Реакция майяра это: Хорошая реакция, Майяр! — The Welder Catherine

Хорошая реакция, Майяр! — The Welder Catherine

Реакция Майяра – одна из самых распространённых реакций в пищевой химии. В английском языке она называется non-enzymatic browning reaction — это означает, что в процессе реакции образуются вещества, придающие продукту коричневый цвет, но это вызвано не деятельностью ферментов, как бывает, например, в случае с надкусанным яблоком, а особенностью продуктов реакции. 

Что касается яблок, то полифенолоксидаза под действием кислорода взаимодействует с полифенолами. Когда яблоко целое, они друг друга «не касаются», потому что оксидаза живет в хлоропластах, окруженных мембраной, а полифенолы в других клеточных тканях. Когда мы разрезаем или кусаем яблоко, то клетки повреждаются, плюс появляется доступ к кислороду, итог — коричневый надрез яблока. Коричневый цвет, потому что продукты этой реакции собираются в длинную полимерную цепочку, что приводит к образованию меланина — коричневого пигмента.

Чтобы понять, происходит ли она в том или ином продукте, нужно знать, есть ли в нём белки, углеводы, а также собираетесь ли вы нагревать продукт. Если ответ «да», то реакция Майяра будет запущена. Стадия её развития будет зависеть от условий нагревания, но об этом поговорим далее.

что такое реакция Майяра

С химической точки зрения, реакция Майяра – это реакция между аминокислотами и сахарами при нагревании. Примеров этой реакции множество: жарка мяса, обжарка кофе, выпечка хлеба и т. д. По мере развития реакции Майяра образуются продукты, обладающие характерными запахом, который порой не даёт устоять перед свежеприготовленным стейком или только что испечённым круассаном.

Но всегда ли появление характерных запахов и вкусов является необходимым? Определённо, нет.

Есть довольно распространённое мнение, якобы в молоке не происходит реакции Майяра. Вернёмся к началу нашего рассуждения и проанализируем, соответствует ли молоко условиям, необходимым для реакции Майяра.

Белки. Безусловно, белки присутствуют в молоке. Это сывороточные белки (преимущественно бета-лактоглобулин и альфа-лактальбумин) и казеины.

Сахара. Тоже да, лактоза – основной молочный сахар, или углевод. Уникален тем, что в природе встречается только в молоке.

Нагревание. Это зависит от наших целей.

пастеризация / ультрапастеризация / стерилизация  

Перед тем как попасть на полки супермаркетов, молоко должно пройти термическую обработку – пастеризацию, ультрапастеризацию или стерилизацию. Это необходимо для обеспечения микробиологической безопасности молока и, как следствие, продления его срока хранения. Каждый из этих методов по-своему эффективен, но в любом случае «запускает» реакцию Майяра в молоке. Выбор метода тепловой обработки определяет не только микробиологические параметры готового продукта, но и его органолептические свойства, то есть все, что мы можем оценить с помощью органов чувств.

Пастеризация – это процесс, отвечающий минимальным требованиям к тепловой обработке. В этом случае молоко нагревают до 85°C на 2-3 секунды. При ультрапастеризации молоко подвергают температуре 135-150°C на 1-10 секунд в зависимости от метода. Стерилизация – это наиболее агрессивный метод тепловой обработки молока. Его выдерживают при температуре 115-120°С от 20 минут. Стерилизованное молоко, как правило, поставляют в больницы и детские учреждения, чтобы исключить возможность отравления. После нагревания любым из способов молоко охлаждают и расфасовывают в обычную или покрытую антисептическим слоем изнутри тару.

Несмотря на то, что в случае ультра- и простой пастеризации молоко нагревается всего на несколько секунд, это приводит ко многим необратимым химическим изменениям в его составе. Помимо инактивации ферментов и уничтожения патогенных бактерий (а в случае ультрапастеризации ещё и их спор, что позволяет молоку храниться около года при комнатной температуре), влияние оказывается и на основные компоненты молока – белки, жиры, углеводы, — и на витамины. Ультрапастеризация ведет к потере 10-30% витамина С, фолиевой кислоты, витаминов B6, B12 и B1.

реакция Майяра в молоке

Итак, происходит ли реакция Майяра в молоке? Безусловно, да. Яркий тому пример – топлёное молоко и варёная сгущёнка, отличающиеся характерным вкусом, запахом и цветом.

Реакция Майяра является необратимым последствием нагревания молока, зависит от его интенсивности и продолжается на протяжении всего срока хранения молока. То есть постоянное нагревание – необязательное условие для реакции Майяра, достаточно однократной температурной обработки с последующим хранением молока.

Несколько слов о природе реакции Майяра. Это комплексная реакция, протекающая в несколько стадий. На начальном этапе под действием температуры аминогруппа белка — в молоке это в основном ε-аминогруппа остатков лизина из κ-казеина и сывороточных белков — реагирует с карбонильной группой основного молочного сахара – лактозы. Иными словами, белки реагируют с лактозой при нагревании. В результате этого взаимодействия образуется промежуточное нестабильное вещество, так называемое основание Шиффа, которое сразу подвергается дальнейшим преобразованиям с образованием раннего продукта Амадори – лактулозил лизина. Именно продукты Амадори на более поздних стадиях реакции Майяра претерпевают множественные изменения с образованием более 3500 характерных летучих ароматических соединений. Эти ароматы могут быть как желательными, так и нет.

Если кратко, то ε-аминогруппа лизина + карбонильная группа лактозы ↔ основание Шиффа ↔ продукт Амадори → меланоидины (высокомолекулярные азотистые соединения коричневого цвета) и полимеризованные белки.

Эта схема очень кратко описывает реакцию Майяра в молоке, поскольку на самом деле происходит множество химических превращений внутри реакции, но она отражает её непосредственную суть.

Стоит отметить, что не все ароматические «душистые» (обладающие запахом) соединения образуются в результате реакции Майяра. Некоторые из них являются продуктами высвобождения сульфгидрильных, или тиоловых, групп (-SH groups, серосодержащие реактивные группы), которые выходят на поверхность сывороточных белков и белков их мембраны жировых глобул в процессе денатурации.

Также каждое молоко обладает своим «естественным» запахом, то есть тем, который оно приобретает в зависимости от корма и метаболизма коров, а также запахом, появляющимся в процессе хранения.

Итак, в молоке из-за нагревания (продолжительного) образуются коричневые пигменты меланоидины, а также множество ароматических и «душистых» соединений. Мы можем видеть эти изменения невооруженным глазом, например, характерный цвет топлёного молока или ряженки, а также будем чувствовать новые запахи, о природе которых мы поговорим дальше.

   Присутствие этих ароматических соединений можно проверить с помощью газовой хроматографии/масс-спектрометрии, то есть с использованием специального оборудования, недоступного всем заинтересованным в контроле органолептических свойств молока.

Поэтому мы поставили цель сравнить ароматический (обладающий запахом) состав разных видов коровьего молока, в первую очередь пастеризованного и ультрапастеризованного, а также безлактозного молока, поскольку из него удален основной молочный сахар – лактоза, соответственно, реакция Майяра должна протекать не в той же мере, что и в обычном молоке с лактозой. Основная задача – сравнить интенсивность запаха холодного и нагретого с помощью паровика кофемашины до разных температур молока. О результатах исследования можно будет говорить уже в начале следующего года, а пока разберемся, что известно о результатах реакции Майяра на данный момент.

   Что же известно о результатах реакции Майяра на данный момент? 

Ультрапастеризованное молоко действительно обладает более интенсивным запахом, чем пастеризованное. Более того, в холодном ультрапастеризованном молоке присутствуют не все ароматы из тех, что есть в нагретом.

Что касается характера ароматов/вкусов, образующихся при нагревании молока, — есть 4 основные группы, которые описывают как: «сернистый или приготовленный/cooked or sulphurous», «нагретый или насыщенный/heated or rich», «карамельный/caramelised» и «жженый, горелый/scorched».

В таблице приводятся некоторые ароматические и «душистые» соединения ультрапастеризованного молока. Как видно, ароматы описываются и как положительные – ванильный, кокосовый, сладкий, — и как нежелательные – землистый, металлический, ржавый.

Таким образом, любое свежее молоко обладает индивидуальным специфическим запахом в зависимости от корма, породы, условий содержания и особенностей метаболизма коров. Этот запах будет меняться в зависимости от температурной обработки, срока и условий хранения. Нагревание и хранение молока приводит к образованию летучих ароматических соединений из белков, углеводов и жиров молока путем сложных превращений. Химические изменения в молоке приводят к образованию новых ароматических (и не только) соединений. Яркий пример — тиоловые группы (содержащие серу), а все серосодержащие соединения интенсивно пахнут. Это в случае денатурации. А при РМ одно из самых преобладающих ароматических соединений – это фурфурол, который пахнет хлебом, злаками. И таких соединений множество.

Эти ароматические соединения могут быть как желательными, так и нет. Важно помнить, что более интенсивное нагревание молока и последующее длительное хранение приводят к образованию большего количества новых ароматов и, как следствие, вкусов. Что касается распространенного вопроса «Образуется ли при нагревании молока акриламид, как это происходит при обжарке кофе?», то нет, он образуется в растительных продуктах. Молоко, мороженое, сыры его не содержат. 

*Акриламид — это вещество, которое образуется в процессе обжарки, например, кофе (и других растительных продуктов), потенциальный канцероген.

Вездесущая реакция Майара

Ольга Владимировна Космачевская,
кандидат биологических наук, Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН
«Химия и жизнь» №2, 2012

Все сознают, что нормальная и полезная еда — есть еда с аппетитом,
еда с испытываемым наслаждением; всякая другая еда, еда по приказу,
по расчету, признается уже в большей или меньшей степени злом…
И. П. Павлов

Химия богата именными реакциями, их более тысячи. Но большинство из них мало о чем скажут человеку, далекому от химии, они для тех, кто понимает. Однако в этом богатом перечне есть одна реакция, с которой все мы сталкиваемся каждый день — всякий раз, когда подходим к плите, чтобы приготовить что-нибудь вкусненькое, или пьем утренний кофе с бутербродом, или пиво вечером с друзьями. Речь идет о реакции Майара, которой в этом году исполняется сто лет. Во Франции в Нанси даже планируют провести юбилейный международный симпозиум, посвященный этой реакции.

За что такие почести? Чем она так примечательна? Да тем, что вездесуща и хорошо знакома каждому. Образование гумуса почв, угля, торфа, сапропеля, лечебных грязей происходит благодаря этой реакции. Но говорить мы будем о куда более привычных и привлекательных вещах — о незабываемом аромате свежезаваренного кофе, испеченного хлеба и жареного мяса, о золотистой поджаристой корочке на буханке и отбивной, об изумительном вкусе этих продуктов. Потому что все перечисленное — это результат реакции Майара.

Первая отбивная и революция

Сложно представить жизнь современного человека без кулинарии, а кулинарию без жарки, варки и выпечки, хотя все прочие живые существа обходятся без термической обработки пищи. Есть данные, что уже синантропы (Homo erectus pekinensis) использовали огонь, а современный Homo sapiens готовил на огне, что называется, с рождения. Так что любовь к жареному и вареному сформировалась очень давно. Но что заставило первобытного человека сунуть пищу в огонь, а потом съесть ее? И почему потом все начали есть обработанную пищу?

Вряд ли мы узнаем, когда и как это произошло. Видимо, по каким-то причинам сырое мясо попало в костер, зажарилось, а наши предки просто не смогли удержаться, чтобы не положить ароматные кусочки в рот. Понятно, что жареный кусочек по вкусу превзошел сырой даже без соли, кетчупа и приправ. Впрочем, понятно это только небиологам. В соответствии с теорией эволюции вкусно должно быть то, что полезно, что содержит ценные компоненты (избыток сладкого вреден, однако нашим предкам этот избыток не грозил). Почему вкусным кажется жареное — это нетривиальный вопрос. Может быть, как раз потому, что приготовленное легче усваивается и вкусовые рецепторы это чувствуют. И вскоре приготовленную пищу стали считать сакральной, «освященной огнем», ведь во время жертвоприношения, когда на огне сжигали потенциальную еду, ее часть в виде дыма возносилась в дар богам.

Интересно, что, если б нынешние человекообразные обезьяны умели жарить и парить, они непременно бы этим занимались. Антропологи Ричард Ранэм из Гарварда и Виктория Уоббер из Института эволюционной антропологии Макса Планка установили, что шимпанзе, бонобо, гориллы и орангутаны предпочитают приготовленную пищу сырой, будь то мясо, морковь или бататы. В чем тут дело — в мягкости готового продукта, его лучшей перевариваемости или его лучшем вкусе — непонятно. Хотя, как мы знаем, домашние животные тоже с удовольствием употребляют «человеческую» еду.

Так или иначе, огонь, сковородки, вертела и кастрюли стали главными инструментами поваров и хозяек, а вкусная теплая еда — одним из самых доступных удовольствий. Как писал Джером К. Джером, «чистая совесть дает ощущение удовлетворенности и счастья, но полный желудок позволяет достичь той же цели с большей легкостью и меньшими затратами».

Однако такой способ приготовления пищи породил куда более значимые, глобальные последствия. Существует любопытная теория, согласно которой термическая обработка пищи повлекла за собой антропогенетическую революцию и послужила отправным пунктом в культурном становлении человека. Наши предки были всеядными животными. Это давало несомненное эволюционное преимущество, поскольку разнообразие потребляемых продуктов было велико, но имело и минусы: сырая грубая пища усваивалась плохо, поэтому приходилось много есть, тратить много времени на добывание пищи. Специалисты подсчитали, что шимпанзе расходует на потребление пищи несколько часов в сутки, а современный человек — немногим более часа (долгие сидения в ресторанах и барах не в счет, здесь основное время уходит на общение). Получается, что термическая обработка пищи, резко повысив КПД переваривания, сократила потребность в ресурсах и подарила нашим предкам свободное время и энергию, которые могли быть затрачены на размышления, познание мира, творчество, создание орудий труда. Иными словами, приготовление пищи дало Homo sapiens возможность стать действительно разумным существом.

О том, как сахара, жиры и белки встречаются на сковородке

Стоит только представить хрустящую золотистую корочку на хорошо прожаренном мясе или буханке свежего хлеба, как начинают течь слюнки. Почему жареная еда такая вкусная и привлекательная на вид?

Три важнейших компонента входят в состав органики, употребляемой в пищу: углеводы, жиры и белки. Не буду останавливаться на биологическом значении этих веществ, поскольку для читателей «Химии и жизни» это очевидно. В данном случае нас будут интересовать некоторые особенности химического строения этих веществ. Углеводы, которые еще называют природными полигидроксиальдегидами и полигидроксикетонами с общей формулой (CH₂O)_n, в составе своих молекул содержат не только гидроксильные группы –ОН, но и карбонильные С=О.

В молекулах природных жиров, триглицеридов (сложные эфиры глицерина и одноосновных жирных кислот) также обязательно присутствуют карбонильные группы.

Белки устроены куда сложнее, это полимеры, цепи которых выстроены из самых разных аминокислот. Свойства белка напрямую зависят от того, какие аминокислоты и в какой последовательности его образуют. Среди 20 аминокислот, составляющих белок, есть несколько наиболее уязвимых с химической точки зрения: лизин, аргинин, триптофан и гистидин. Их молекулы содержат свободные аминогруппу (–NH₂), гуанидиновую группу (–С(NH₂)₂), индольное и имидазольное кольца.

Уязвимы они потому, что перечисленные группы даже в составе белковой молекулы легко вступают в реакцию с карбонильной группой (С=О) углеводов, альдегидов и липидов. (У других аминокислот аминогруппа вступает в реакцию, только если эта аминокислота свободная или концевая в полипептидной цепи.) Нужна лишь повышенная температура, огонь или плита. Эта реакция известна в пищевой химии как реакция сахароаминной конденсации, или как реакция Майара.

История ее открытия — запутанное дело. Считается, что Майар был первым, кто обнаружил активное взаимодействие сахаров с аминокислотами. Однако справедливости ради следует отметить, что впервые подобную реакцию наблюдали П. Брандес и Ц. Штоэр в 1896 году, нагревая сахар с аммиаком.

В 1912 году молодой французский врач и химик Луи Камилл Майар начал изучать взаимодействие между аминокислотами и пищевыми сахарами, глюкозой и фруктозой. На исследование его вдохновило желание отыскать возможные пути синтеза полипептидов. В течение нескольких часов он кипятил водные растворы сахара или глицерина с аминокислотами и обнаружил, что в реакционной смеси образуются некие сложные соединения желто-коричневого цвета. Ученый принял их за пептиды и поспешил опубликовать результаты в «Compte Rendu de I’Academie des Sciences». Однако это был тот случай, когда исследователь выдал желаемое за действительное — дело в науке обычное. Никакие экспериментальные данные не подтверждали это чисто умозрительное заключение. К чести Майара, он это понял, продолжил исследования и уже в следующем, 1913 году обнаружил большое сходство образующихся коричневых пигментов с гуминовыми веществами почвы. Это были не пептиды, а что-то другое.

Эстафету исследований в этом направлении подхватили российские ученые из лаборатории физиологии растений Петербургского университета. Вскоре после Майара, в 1914 году, С. П. Костычев и В. А. Бриллиант описали продукты, образующиеся в реакции между аминокислотами и сахарами в дрожжевом автолизате — продукте самопереваривания дрожжевых клеток. Русские ученые активно исследовали образование «новых азотистых соединений», окрашивающих раствор в темно-бурый цвет при добавлении глюкозы или сахарозы к дрожжевому автолизату, и доказали, что материалом для синтеза служат сахар и аминокислоты, которые с легкостью реагируют без вмешательства ферментов.

Из всех исследователей, занимавшихся этой проблемой, основные результаты все же были получены французским ученым, установившим, что взаимодействие кетогруппы (С=О) сахара с аминогруппой (–NH₂) аминокислоты происходит в несколько стадий. Поэтому сахароаминная реакция известна под именем реакции Майара. С 1910 по 1913 год французский ученый опубликовал около 30 сообщений, которые легли в основу его докторской диссертации «Генезис белков и органических материалов. Действие глицерина и сахаров на аминокислоты».

Но, как это часто бывает в науке, открытие Майара не получило должного признания при его жизни. Только в 1946 году ученые снова заинтересовались этой реакцией. И сегодня о реакции Майара мы знаем уже очень многое. Прежде всего это не единичная реакция, а целый комплекс процессов, которые протекают последовательно и параллельно без участия ферментов и придают реакционной массе коричневый цвет. Главное, чтобы в реакционной смеси присутствовали карбонильные группы (в составе сахаров, альдегидов или жиров) и аминогруппы (белки). Понятно, что такой букет реакций приводит к образованию многочисленных продуктов различного строения, которые в научной литературе обозначаются термином «конечные продукты гликирования». В эту группу входят и алифатические альдегиды и кетоны, и гетероциклические производные имидазола, пиррола и пиразина. Именно эти вещества — продукты сахароаминной конденсации — ответственны за формирование цвета, аромата и вкуса продуктов, подвергнутых термической обработке. Эта реакция ускоряется с повышением температуры и поэтому интенсивно протекает при варке, жарке и выпечке.

Меланоидины: добро и зло

О том, что реакция Майара прошла, можно судить по золотисто-коричневой корочке на хлебе, зажаренных рыбе, мясе, по коричневому оттенку высушенных фруктов. Цвет термически обработанному продукту придают темноокрашенные высокомолекулярные вещества меланоидины (от греческого «меланос», что означает «черный»), которые образуются на последней стадии реакции Майара. Однако цвет стандартных меланоидинов — не черный, а красно-коричневый или темно-коричневый. Меланоидины образуют черные пигменты, подобные гуминовым веществам, лишь в том случае, если огонь был слишком силен или вы забыли о жарящейся на сковородке картошке, пироге в духовке и безнадежно сожгли их. Сам же термин «меланоидины» в 1897 году предложил О. Шмидеберг. (Кстати, «Химия и жизнь» однажды уже обращалась к теме меланоидинов; см. 1980, № 3.)

Кофе, какао, пиво, квас, десертное вино, хлеб, жареные мясо и рыба… Пока мы пьем и едим все это, реакция Майара и ее продукты, меланоидины, с нами. Мы потребляем около 10 г меланоидинов каждый день, поэтому так важно знать об их пользе и вреде.

По химической сути меланоидины — это широкий спектр нерегулярных полимеров разнообразного строения, включая гетероциклические и хиноидные структуры, с молекулярной массой от 0,2 до 100 тысяч дальтон. Механизм их образования достаточно сложен и до конца не изучен — слишком уж много промежуточных продуктов, которые взаимодействуют между собой и с исходными веществами.

Образование меланоидинов сопровождается появлением множества ароматических веществ: фурфурола, оксиметилфурфурола, ацетальдегида, формальдегида, изовалерианового альдегида, метилглиоксаля, диацетила и других. Именно они придают незабываемый, аппетитный аромат свежеиспеченному хлебу, плову, шашлыку. Еще в 1948 году создатель нашей лаборатории в Институте биохимии им. А. Н. Баха В. Л. Кретович (впоследствии член-корреспондент РАН) и Р. Р. Токарева обнаружили, что в растворах глюкозы в присутствии аминокислот лейцина и валина образуются специфические тона корки ржаного хлеба, а в присутствии глицина — карамельный аромат. Чем не способ получения вкусовых и ароматизирующих добавок?

Традиционные рецепты приготовления блюд и напитков включают стадии обработки пищи, на которых образуются меланоидины. Например, темные сорта пива своим насыщенным цветом обязаны меланоидинизированному солоду. А вкусовые добавки и ароматизаторы — это готовые продукты реакции Майара, которые получают отдельно и добавляют в продукты и напитки в качестве естественных красителей и усилителей вкуса. Ароматизаторы и приправы для фастфуда — того же происхождения. Например, пищевую добавку с ароматом тушеной грудинки получают микроволновой сушкой ферментативного гидролизата мяса говядины.

Однако вертится на языке вопрос — а не опасны ли эти вещества? Ведь только и слышишь: не ешьте жареного, в поджаристой корочке содержится всякая канцерогенная дрянь. Давайте разберемся.

Сегодня в научной литературе накоплено огромное количество данных о полезных свойствах меланоидинов — антиоксидантных, антимикробных, иммуномодулирующих, а также об их способности связывать ионы тяжелых металлов. Впервые антиоксидантная активность продуктов реакции Майара была обнаружена в 1961 году в экспериментах с вареным мясом. Затем было показано, что вареное мясо ингибирует перекисное окисление липидов, а в роли собственно ингибиторов выступают меланоидины и мальтол, образующиеся в говядине при варке.

Сегодня ученые, исследующие природу антиоксидантной активности меланоидинов, предполагают, что она связана со структурой этих веществ, которые содержат систему сопряженных двойных связей в гетероциклических и хиноидных звеньях.

Именно такая структура позволяет им обезвреживать свободные радикалы и захватывать металлы. И для организма это чрезвычайно полезно. Скажем, связывая железо (Fe²⁺), меланоидины не дают ему взаимодействовать с перекисью водорода в организме с образованием сильного окислителя и разрушителя — гидроксильного радикала (НО^∙). Также они могут восстанавливать пероксильные липидные радикалы (ROO^∙).

Еще одно достоинство — антимикробная активность. В недавно опубликованной статье в журнале «Food & Function» (Ulla Mueller et al. «Food & Function»., 2011, vol. 2, 265–272) антимикробное действие меланоидинов кофе связывают с образованием в ходе реакции Майара перекиси водорода (H₂O₂), подавляющей рост бактерий Escherichia coli и Listeria innocua.

Исследование меланоидинов кофе, развернувшееся в последние годы, подталкивает ученых к мысли, что они могут уменьшать риск заболевания раком. Кроме того, они усиливают синтез ферментов семейства глютатион-S-трансферазы, которые обезвреживают различные ксенобиотики (Somoza V. et al. «Molecular Nutrition & Food Research». 2005, 49, 663–672). А группа ученых из Кореи, Японии и Германии в экспериментах на крысах показала, что аромат жареных кофейных зерен (результат реакции Майара) изменяет работу некоторых генов и при этом в мозгу синтезируются белки, снижающие последствия стресса из-за лишения сна. Таким образом, научно доказано, что просыпаться на запах кофе полезно для мозга, а потому и приятно. Впрочем, это вовсе не означает, что кофе надо пить с утра и до вечера. Руководитель исследований невролог Йосинори Масуо из Научно-исследовательского центра технологий здравоохранения (Япония) считает, что можно просто понюхать кофе, вместо того чтобы пить (Han-Seok Seo et al. «Journal of Agricultural and Food Chemistry». 2008, 56 (12), 4665–4673).

Благодаря полезным свойствам меланоидины нашли применение не только в кулинарии и пищевой химии. В народной медицине с незапамятных времен используют целебные свойства этих веществ. Отвар ржаных колосьев применяют для лечения заболеваний органов дыхания как отхаркивающее мягчительное средство; припарки из ячменного солода рекомендуют при воспалениях кожи и геморрое; отварами ячменного зерна лечат заболевания желудочно-кишечного тракта, почек, мочевых путей и нарушения обмена веществ. В России XIX века был популярен так называемый госпитальный квас, который входил в рацион каждого солдата, выздоравливающего после ранения, для поднятия сил. Видимо, отсюда и поговорка «Русский квас много народу спас».

А что сегодня? Наружное антисептическое средство для лечения кожных заболеваний — «жидкость Митрошина» — представляет собой концентрат меланоидинов, получаемый термической обработкой овса, пшеницы и ржи. Препарат под названием «Холеф» (фехолин), густой экстракт из пшеничных зародышей, разрешен к применению для лечения больных с различными формами прогрессивной мышечной дистрофии. В Научно-практическом центре по животноводству Национальной академии наук Республики Беларусь получили опытную партию кормовой антиоксидантной добавки «Эколин-1», которая представляет собой композицию из гидролизатов ростков солода и торфа. В Ставропольском политехническом институте из отходов молочного производства сделали препарат «ПВ», рекомендованный для широкого применения в растениеводстве и животноводстве в качестве биостимулятора. К сожалению, все эти препараты выпускают локально и малыми партиями

Но вернемся к меланоидинам, которые мы едим. Они, надо признать, плохо расщепляются пищеварительными ферментами и не всасываются в желудочно-кишечном тракте. Казалось бы, минус? Не будем торопиться. Меланоидины выполняют ту же функцию, что и пищевые волокна, улучшают пищеварение и стимулируют рост бифидобактерий, то есть обнаруживают свойства пребиотиков. А это уже скорее плюс.

И все-таки откуда разговоры о канцерогенах? Дело в том, что при слишком высоких температурах в ходе реакции Майара могут образовываться действительно токсичные или канцерогенные вещества. Например, акриламид появляется при запекании или жарке выше 180°C, когда происходит термическое разложение меланоидинов. Вот почему пережаривать не стоит. Но что интересно: исследователи выяснили, что некоторые продукты реакции Майара стимулируют образование ферментов, участвующих в связывания токсинов, в том числе и акриламида. А в модельных экспериментах было показано, что высокомолекулярные меланоидины подавляют образование канцерогенных N-нитрозаминов (Kato H. et al. «Agricultural and Biological Chemistry». 1987, vol. 51 (5), pp. 1333–1338).

Конечно, к минусам можно приписать и то, что реакция Майара снижает биологическую ценность белков, поскольку аминокислоты, особенно лизин, треонин, аргинин и метионин, которых чаще всего недостает в организме, после соединения с сахарами становятся недоступными для пищеварительных ферментов и, следовательно, не усваиваются. Но, согласитесь, стоит пожертвовать небольшой толикой аминокислот ради аппетитного вида, аромата и вкуса еды. Ведь без этих факторов, согласно И. П. Павлову, полноценное переваривание пищи невозможно. Еда должны быть вкусной!

Чтобы оценить вред или пользу меланоидинов, необходим комплексный подход к проблеме, учитывающий все факторы и детали, часто взаимоисключающие. Сделать это трудно. Но есть другой путь. Сегодня для реакции Майара найдены катализаторы и ингибиторы, мы знаем, как влияют рН среды, температура, влажность, соотношение компонентов на ход этого процесса и спектр образующихся веществ. С этими параметрами обычно считаются при производстве пищевых продуктов. Иными словами, реакция Майара становится управляемой, поэтому вполне возможно получать в процессе кулинарной обработки стандартные продукты, только с полезными для организма свойствами.

Загар, тайнопись и плащаница

С реакцией Майара мы можем встретиться не только на кухне. Если вы используете средства для автозагара (намазался кремом и без всякого солнца стал коричневым), то вы наблюдаете эту реакцию на своей коже. Действующее начало автозагара — дигидроксиацетон, получаемый из сахарной свеклы и сахарного тростника, а также ферментацией глицерина. Дигидроксиацетон или его производное эритрулоза вступают в реакцию с аминокислотами белков кожного кератина, в результате чего образуются меланоидины, похожие на естественный пигмент кожи — меланин. В течение нескольких часов по мере образования меланоидинов кожа приобретает цвет натурального загара. Этой процедурой достаточно часто пользуются культуристы и фотомодели, которым нужно быстро приобрести красивый цвет кожи.

Считается, что в отличие от солнечных ванн автозагар позволяет получить естественный коричневый оттенок кожи без вреда для здоровья. Однако это не совсем так. У автозагара есть один недостаток: он не защищает кожу от воздействия ультрафиолетового излучения, как это делают естественные пигменты меланины. Но это полбеды, хуже другое. Меланоидины — фотосенсибилизаторы, при поглощении света они вступают в химические реакции, в частности, с образованием супероксидного анион-радикала (O2^∙–). Поэтому покрытая меланоидинами кожа более чувствительна к действию солнечного света. После 40 минут пребывания на солнце в такой коже образуется в три раза больше свободных радикалов по сравнению с необработанной кожей.

А вот еще одно старое применение реакции Майара. Помните детский рассказ Михаила Зощенко «Иногда можно кушать чернильницы» о том, как В. И. Ленин, чтобы перехитрить надзирателей, писал молоком революционные тексты на страницах обычных художественных книг? Молоко — классические невидимые (симпатические) чернила. Чтобы проявить текст, написанный молоком, достаточно нагреть бумагу с посланием над свечой или прогладить утюгом. Невидимый текст станет видимым, коричневым. Что это, как не реакция Майара — взаимодействие белков молока с молочным сахаром лактозой! Кстати, на роль симпатических чернил подойдут любые доступные вещества, содержащие карбонильные и аминные группы, например слюна, пот, сок лука и многое другое.

В итальянском городе Турине, в соборе Святого Иоанна Крестителя, хранится одна из самых почитаемых и загадочных христианских реликвий — Туринская плащаница, льняное полотно, в которое, по преданию, Иосиф из Аримафеи завернул тело Иисуса Христа после его снятия с креста. На этом полотне неведомым образом запечатлелись лик и тело Христа. Причина возникновения нечеткого желтовато-коричневого отпечатка остается и поныне загадкой (см.: Верховский Л. И. «Химия и жизнь», 1991, № 12; Левшенко М. Т. «Химия и жизнь», 2006, № 7). Есть несколько версий, за счет каких химических реакций получилось изображение. Однако камнем преткновения остается тот факт, что коричневый цвет находится только на поверхности волокон, остающихся внутри непрокрашенными. Очень похоже, что мы имеем дело с сахароаминной реакцией.

Химики Раймонд Роджерс из Национальной лаборатории Калифорнийского университета в Лос-Аламосе и Анна Арнольди из Миланского университета попытались в эксперименте воссоздать способ окраски полотна за счет сахароаминной реакции. Специально для этого эксперимента была изготовлена льняная ткань по технологии, описанной 2000 лет назад Плинием Старшим. Для осуществления реакции Майара, как вы уже знаете, необходимы сахар и аминогруппы. Откуда на полотне сахар? Дело в том, что нити, из которых делали ткань, покрывали крахмалом, защищая их от повреждений. Готовую ткань отмывали в экстракте мыльнянки лекарственной (Saponaria officinalis), которая содержит сапонины — поверхностно-активные вещества. Они гидролизуют полисахарид крахмал до моно- и олигосахаридов: галактозы, глюкозы, арабинозы, ксилозы, фукозы, рамнозы и глюкуроновой кислоты. Поскольку ткань сушили на солнце, то вещества из промывочных вод концентрировались на поверхности волокон.

На ткань, изготовленную по описанной технологии, исследователи воздействовали продуктами разложения белков, содержащими аминогруппы, — путресцином (1,4-диаминобутан) и кадаверином (1,5-диаминопентан). Оба этих вещества называют «трупными газами», так как они образуются при разложении белков после смерти. На поверхности льняной ткани продукты гидролиза крахмала взаимодействовали с путресцином и кадаверином и получалась действительно поверхностная окраска. Так Роджерс и Арнольди подтвердили гипотезу о сахароаминном происхождении изображения на плащанице и о том, что эта реакция действительно могла иметь место при обертывании тела в льняную ткань тех времен.

Меланоидины у колыбели жизни

Учитывая легкость, с которой протекает реакция Майара, можно предположить, что на заре возникновения жизни на Земле, в пребиотической гидросфере, то есть в первичном бульоне, взаимодействие сахаров с аминокислотами (альдегидов с аминами) шло активно и повсеместно. А это, в свою очередь, приводило к образованию меланоидиновых полимеров. Впервые мысль о том, что абиогенно образующиеся меланоидины могут быть прототипом современных коферментов, высказали Д. Кеньон и Г. Штейнман в 1969 году. И это предположение было сделано не случайно.

Дело в том, что в состав меланоидинов входят структуры с сопряженными двойными связями, придающие полимерам электрон-транспортные свойства. Поэтому меланоидиновые матрицы могут имитировать некоторые типичные биохимические реакции, протекающие в клетках: оксидо-редуктазные, гидролазные, синтазные и др. Кроме того, эти полимеры способны связывать тяжелые металлы, которые играют важную роль в функционировании многих ферментов. Вот почему образование подобных полимеров могло послужить отправной точкой в формировании основных типов биохимических реакций. А. Ниссенбаум, Д. Кеньон и Дж. Оро в 1975 году высказали гипотезу, что меланоидины — это протоферментные системы, игравшие роль матрицы в процессах зарождения жизни до возникновения систем с более высокой специфичностью.

В Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН сотрудники лаборатории эволюционной биохимии на протяжении многих лет моделируют процессы предбиологической эволюции и исследуют роль меланоидиновых пигментов в усложнении углеродсодержащих соединений. Кандидат биологических наук Т. А. Телегина с коллегами в этих экспериментах доказала, что меланоидины обладают каталитической активностью, в частности содействуют образованию пептидных связей между аланинами. Меланоидиновые пигменты наносили на силикагель и помещали в кварцевую колонку, облучаемую ультрафиолетом, через которую циркулировал раствор аланина. В результате были получены ди-, три- и тетрааланиновые пептиды. Причем их концентрация оказалась в десять раз выше концентрации диаланина, который получали в эксперименте с немодифицированным силикагелем. Этот результат показал преимущество меланоидиновых матриц над неорганическими в процессе абиогенеза.

Реакция Майара и карбонильный стресс

Наш рассказ о реакции Майара и ее продуктах был бы неполным, если бы мы умолчали о том, что эта реакция протекает и в организме человека. Впервые на это обратили внимание уже упоминавшиеся русские ученые П. А. Костычев и В. А. Бриллиант. В отличие от Майара они проводили сахароаминную реакцию при более низких температурах, 30–55°С, и тогда предположили, что она, возможно, протекает и в клетках. Вот что они писали в своей статье в «Известиях Императорской Академии наук» в 1916 году: «Таким образом, аминокислоты реагируют с сахаром даже без вмешательства ферментов. (…) При современном состоянии науки было бы, конечно, совершенно произвольным отрицание за такими свободно происходящими реакциями физиологического значения, особенно если принять во внимание, что условия, необходимые для осуществления реакции между сахаром и аминокислотами, легко могут иметь место в протоплазме живых клеток, так как там вполне возможны концентрации участвующих в реакции веществ».

Действительно, теперь доподлинно известно, что эта реакция протекает и в организме человека, способствуя развитию некоторых патологий. Сейчас внимание исследователей приковано к гликированию — неферментативной модификации биологических макромолекул по реакции Майара, когда с белками взаимодействуют активные карбонильные соединения, накапливающиеся при перекисном окислении липидов и при диабете.

Из-за накопления активных карбонильных соединений, которое происходит по мере старения или при диабете, развивается так называемый карбонильный стресс. В первую очередь страдают, то есть гликируются, долгоживущие белки: гемоглобины, альбумины, коллаген, кристаллины, липопротеиды низкой плотности. Последствия самые неприятные. Например, гликирование белков мембраны эритроцита делает ее менее эластичной, более жесткой, в результате чего ухудшается кровоснабжение тканей. Из-за гликирования кристаллинов мутнеет хрусталик и, как следствие, развивается катаракта. Модифицированные таким образом белки мы можем обнаружить, а значит, они служат маркерами атеросклероза, сахарного диабета, нейродегенеративных заболеваний. Сегодня одна из фракций гликированного гемоглобина (HbА_1c) — в числе основных биохимических маркеров диабета и сердечно-сосудистых заболеваний. Снижение уровня HbА_1c на 1% уменьшает риск каких-либо осложнений при диабете на 20%.

У себя в лаборатории, в Институте биохимии им. А. Н. Баха, мы разработали экспериментальную систему, которая моделирует условия карбонильного стресса. В качестве активного карбонильного соединения мы использовали метилглиоксаль. Оказалось, что при взаимодействии лизина с метилглиоксалем получаются свободнорадикальные продукты, способные восстанавливать окисленный гемоглобин. Благодаря этому оксид азота (NO) более эффективно связывается с железом гемовой группы, то есть происходит нитрозилирование гемоглобина. В некоторых случаях образуется нитригемоглобин, причем эти процессы могут происходить и непосредственно в крови, например, у больных диабетом. Особенности функционирования таких модифицированных гемоглобинов еще предстоит изучить.

Кстати, из-за образования нитримиоглобина может происходить так называемое нитритное позеленение колбасы или ветчины, если нарушена технология обработки мяса нитритом натрия (пищевая добавка Е250). Хотя обычно ее добавляют для придания мясным продуктам аппетитного розового цвета (не путать с позеленением, вызванным разрушением гемовой группы в результате обычной порчи продукта!).

Рассказ о реакции Майара и меланоидинах подошел к концу. Хотя, возможно, это, как говорил Козьма Прутков, начало того конца, которым заканчивается начало. В статье лишь несколькими штрихами обозначена «вездесущность» реакции Майара, однако мы надеемся, что у читателя сложилось первое представление о важности процессов, протекающих между сахарами и аминокислотами в природе.

Автор благодарит профессора А. Ф. Топунова и доктора биологических
наук К. Б. Шумаева за помощь при подготовке и написании статьи.

Реакция Майяра — это… Что такое Реакция Майяра?

Румяная корочка на пироге — это последствие реакции Майяра

Реакция Майяра (англ. Maillard reaction)— это химическая реакция между аминокислотой и сахаром, которая, как правило, происходит при нагревании. Примером такой реакции является жарка мяса или выпечка хлеба, когда в процессе нагревания пищевого продукта возникает типичный запах, цвет и вкус приготовленной пищи. Эти изменения вызваны образованием продуктов реакции Майяра. Вместе с карамелизацией реакция Майяра является формой неферментативного потемнения (побурения). Названа в честь французского химика и врача Луи Камилла Майяра, который одним из первых исследовал реакцию в 1910-х годах.

Химия

Реакция включает несколько этапов:

1. Реактивная карбонильная группа сахара (в его открытой конформации) взаимодействует с нуклеофильной группой аминокислоты с образованием нестабильного N-замещенного гликозиламина и воды.
2. Гликозиламин самопроизвольно подвергается перегруппировке Амадори и превращается в кетозамин
3. Кетозамины в ходе последующих реакций могут превратиться в

• редуктоны,
• короткоцепочечные гидролитические продукты (диацетил, аспирин, пирувальдегид и др.) или
• бурые нитрогенные полимеры и меланоидины

Различные сахара обладают различной реактивностью. Реактивность сахаров следует в таком порядке: пентоза > гексоза > дисахарид. Так, например, фруктоза в 100—200 раз более активна, чем глюкоза. Реакция Майяра приводит к образованию многочисленных продуктов порой с довольно сложной и часто ещё не исследованной структурой.

Промышленность

Пищевая промышленность производит многие продукты реакции Майяра, которые используются для придания желаемого вкуса и запаха продуктам питания.

Медицина

Реакция Майяра происходит не только при приготовлении пищи. Эта реакция между белками и сахарами имеет место и в живом организме. В нормальных условиях скорость реакции настолько мала, что её продукты успевают удаляться. Однако, при резком повышении сахара в крови при диабете реакция значительно ускоряется, продукты накапливаются и способны вызвать многочисленные нарушения (например, гиперлипидемии). Особенно это выражено в крови, где резко повышается уровень повреждённых белков (например, концентрация гликозилированного гемоглобина является показателем степени диабета). Накопление изменённых белков в хрусталике вызывает тяжёлое нарушение зрения у больных диабетом. Накопление некоторых поздних продуктов реакции Майяра, так же как и продуктов окисления, которое происходит с возрастом, приводит к возрастным изменениям в тканях. Пока не найдено лекарств, способных ингибировать реакцию Майяра в организме, хотя некоторые агенты (аминогуанидин) существенно снижают реакцию in vitro. Наиболее распространённым поздним продуктом реакции является карбоксиметиллизин, производное лизина. Карбоксиметиллизин в составе белков служит биомаркёром общего оксидативного стресса организма. Он накапливается с возрастом в тканях, например в коллагене кожи, и повышен при диабете.

Продукты реакции

2-ацетил-1-пирролин

Примеры продуктов реакции:

• 6-ацетил-1,2,3,4-тетрагидропиридин — запах печёного хлеба, бисквита.
• 2-ацетил-1-пирролин — запах приготовленного риса.

Ссылки

Кулинарное. Реакция Майяра. : olga_pro — LiveJournal

Что-то захотелось мне написать про умное. А все из-за того, что буквально в течение нескольких дней я дважды столкнулась с весьма странными представлениями о реакции Майяра у кулинарных блогеров. Они в принципе про нее, конечно, знают, штука хорошая и полезная, но вот их абсолютная убежденность в том, что Майяр идет только при высоких и очень высоких температурах, буквально на грани с обугливанием меня изрядно обескуражила, тем более, что люди в целом грамотные и кулинары отличные.

Сначала для тех, кто не знает, и не слышал — вставлю определение из Вики: Реакция Майяра (реакция сахароаминной конденсации) — химическая реакция между аминокислотами и сахарами, которая происходит при нагревании. Примером такой реакции является жарка мяса или выпечка хлеба, в ходе которых в процессе нагревания пищевого продукта возникает типичный запах, цвет и вкус приготовленной пищи. Эти изменения вызваны образованием продуктов реакции Майяра — меланоидинов. Названа в честь французского химика и врача Луи Камиля Майяра, который одним из первых исследовал реакцию в 1910-х годах. Меланоидинов, и других продуктов реакции — многие тысячи, далеко не все из них изучены, но десятка два активно используются в качестве ароматизаторов и вкусовых добавок в пищевой химии.

По сути — все правильно. А на деле из-за таких вот примеров и возникает у людей ощущение, что для запуска реакции Майяра нужно что-нибудь либо зажарить, либо запечь при температуре под 200 градусов. Вдобавок у того же хлеба цвет и запах часто обусловлены не столько пресловутым Майяром, сколько реакцией карамелизации сахаров. И если уж приводить пример классического «чистого» Майяра, то это будет хорошо всем знакомое топленое молоко. Причем реакция запускается даже не при 100 градусах, а значительно раньше — думаю, все обращали внимание на разницу во вкусе свежего и пастеризованного молока. Больше того, Майяр идет даже при комнатной температуре, просто очень медленно, и не всегда это на пользу продукту.

Конечно, зависимость от температуры есть. Несомненно при более высокой температуре реакция Майяра идет быстрее. Чтобы добиться того же количества меланоидинов, что и при жарке, при низкой температуре нужно готовить гораздо дольше. Поэтому стейк в сувиде держат 5-6 часов, бульон для фо варят ночь, а для соуса демигляс бульон выпаривается больше суток. Та же история со всеми длительными тушениями, от тажина до беф бургиньона. Поэтому многочасовое приготовление какой-нибудь вкусняшки присутствует обычно почти во всех кухнях с избытком дров.

Далее, для запуска реакции Майяра должны быть ингредиенты для этой самой реакции, т.е. моносахара и свободные аминокислоты. При этом далеко не все сахара и аминокислоты одинаково в этом смысле полезны. Например, фруктоза в 200 раз более активна, чем глюкоза. А рибоза — пятиатомный сахар, образующийся при гидролизе нуклеозидов — так и почти в тысячу. Что это значит? Разберем на примере всеми любимого стейка. Во время выдержки в стейках идет процесс автолиза (кому любопытно, информацию можно найти у меня по тегу «стейки»), при этом образуются свободные аминокислоты от деструкции белка, и сахар рибоза от гидролиза рибонуклеиновых кислот и АТФ. Когда дело доходит до приготовления, аминокислоты реагируют с рибозой, и вуаля — получаем тот самый уникальный вкус стейка. Если одного из компонентов в достаточном количестве нет — хоть убейся, реакция не пойдет, даже с самыми лучшими продуктами. Поэтому лучше заранее озаботиться об обеспечении Майяра «топливом» — например, почему мед лучше для Майяра, чем обычный сахар? Потому что мед содержит массу чистой фруктозы, со всеми вытекающими.

Едем дальше. Следующий немаловажный фактор — это кислотность. Чем выше кислотность, тем медленнее идет реакция Майяра. Поэтому даже не рассчитывайте на нее при зажаривании шашлыка в кислом маринаде. Именно по этой причине томатную пасту в соус демигляс кладут только на последних этапах, а на первых только кости, мясо и овощи. И сок лайма в бульон для фо льют в конце, а вот пару-тройку ложек пальмового сахара кладут сразу. Так что ни в коем случае не нужно мариновать тот же стейк в чем-то кислом — это выйдет просто маринованное мясо, а вовсе не стейк. В нем есть своя прелесть, но румяная корочка на жареном мясе будет в этом случае исключительно результатом карамелизации, ну или высокотемпературной деструкции миоглобина. Кроме того, рН влияет на количественный состав химических соедине­ний, формирующих вкус продукта. Например, при высоких значениях рН преобла­дают пиразины, редуктоны и продукты их распада, а при низких – фураны и особен­но 2-фуранкарбоксиальдегиды. Еще раз — высокая кислотность не отменяет Майяра вовсе, но влияет на итоговый вкус и скорость реакции.

Еще одна важная штука — количество влаги. Тут очень нелинейная зависимость, потому что при образовании меланоидинов иногда вода участвует в реакции, а иногда нет. Но так или иначе совсем «на сухую» реакция идет плохо, ну и в сильном разведении тоже, так что тут нужна золотая середина.Знаменитое «подсушивание» стейка в процессе выдержки как раз и работает на повышение концентрации реагентов и увеличение скорости реакции в толще мяса даже при температуре в 55 градусов. Но если мы хотим запустить Майяра при температуре 100 градусов и ниже, вода сразу становится очень-очень важна, потому что она обеспечивает циркуляцию сахаров и аминокислот, и повышает вероятность их встречи, вспоминаем пресловутое топленое молоко.

Штука не очень важная, но интересная — ионы железа и меди увеличивают скорость реакции Майяра. Т.е. мясо и печень тут в выигрыше, ну и свекла с тыквой. А вот поваренная соль никакого эффекта не дает.

Ну и всякие технологические хитрости — например, в консервной банке реакция Майяра идет после окончания варки в автоклаве еще аж две недели, если, конечно, в банке еще есть сахар и свободные аминокислоты. Технологи это называют «продукт вкус набирает». А чтобы реагенты были в наличии, в банки часто кладут добавки в виде ингредиентов для Майяра в чистом виде, чаще всего это глюкоза как сахар, и лизин как аминокислота. Для более сложных вкусоароматических вещей используют, к примеру, метионин и галактозу. Метионин содержит серу, поэтому и ароматика получается специфическая, мясная.

Ну и честно украденная табличка из американского учебника по пищевым технологиям:

Выше 400°F (200°C) — в основном карамелизация, с возможностью сжигания при длительном нагревании;

~ 330°-400°F (165-200°C) — увеличение карамелизации при более высоких температурах, при котором расходуются сахара и это тормозит реакцию Майяра в верхней части этого температурного диапазона;

~ 300-330°F (150-165°C) — реакция Майяра идет быстро, вызывая заметное потемнение в течение нескольких минут, при достаточном количестве свободных исходных составляющих;

~ 212-300°F (100-150°C) — реакция Майяра идет медленнее, так как температура понижается, обычно требуется много часов около точки кипения воды для ее окончания, обычно используется при длительном запекании мяса на низких темрпературах;

~ 130-212°F (55-100°C) — реакции Майяра требуется вода, с высоким содержанием аминокислот и моносахаров, и щелочная среда, чтобы заметно продвинуться в считанные часы, но может занять и несколько дней

Ниже 130°F (55°C) — Ферментативное потемнение часто более значимо во многих продуктах, чем Майяр, но Майяр все еще будет происходить в течение периодов от дней или месяцев до лет, с постепенно более длительным периодом времени при более низких температурах.

Все о реакции Майяра или «вкусная» пищевая химия

Учёные по праву считают реакцию Майяра одной из самых интересных и важных в химии пищи, но несмотря на свой солидный возраст, она хранит ещё немало тайн. Реакция Майяра – самая «вкусная», и именно она делает пищевые продукты ароматными и красивыми.

Запутанная история открытия

Работая над изучением путей синтеза белков, в 1912 году молодой француз, врач и химик Луи Майяр смешивал аминокислоты и сахара, нагревал растворы и наблюдал за реакцией. Ученый заметил образование в пробирке соединений коричневого цвета. Что за вещества образовались в процессе реакции, Майяр не установил. Он отметил лишь их сходство с гуминами почвы. Позже, выходит более 30 публикаций и докторская диссертация Майяра «Генезис белков. Действие глицерина и сахаров на аминокислоты», где автор установил несколько стадий в протекании этого взаимодействия. Жаль при жизни ученому слава не досталась, химической реакцией Майяра заинтересовались более детально химики в 1946 году. Именно тогда в журнале Journal of Agricultural and Food Chemistry вышла статья американского химика Джона Джорджа о стадиях и значении этой реакции в приготовлении пищи. Но сахароаминная реакция все же гордо носит имя француза первооткрывателя.

Химизм реакции

Реакция Майяра, или меланоидинообразование – сложный химический процесс, который происходит между аминокислотами и сахарами в процессе нагревания. Все начинается с конденсации сахаров (глюкозы, сахарозы и фруктозы) первичными аминогруппами белков и пептидов. Образовавшиеся соединения претерпевают ряд превращений, в результате которых образуются ациклические, гетероциклические, полимерные вещества. Именно они и делают «вкусной» химическую реакцию Майяра. Химия процесса очень сложная, ведь образуются сотни химических соединений, большинство из которых и сегодня не идентифицированы. Для описания масштабов меланоидинообразования следует понять следующее: любой продукт, в составе которого содержатся аминокислоты и простые углеводы при термической обработке выделяет продукты реакции: меланоидины. Что это за вещества и какова их роль?

Продукты реакции

Продукты реакции  Майяра формируют вкус и аромат пищи после термической обработки. Кроме того, меланоидины  являются темноокрашенными веществами, благодаря которым на продуктах образуется румяная корочка. Такие продукты как хлеб, топленое молоко, пироги и даже жареный картофель содержат продукты взаимодействия аминокислот и сахаров. В зависимости от вида сахара меняется и реактивность. Наиболее реактивно способной считается пентоза. Фруктоза, кроме того, что считается наиболее сладким сахаром, является в 100-200 раз активнее глюкозы.

Разнообразие ароматов реакции Майяра зависит от условий протекания и от исходных продуктов. Некоторые аминокислоты имеют атом серы в своем составе, что еще больше увеличивает число возможных продуктов реакций. Вот эти группы соединений образуются в процессе реакций Майяра – пирролы, пиридины, пиразины, имидазолы, оксазолы, фурантиолы, альдегиды Штреккера, алкилпиразины и т.д. Из конкретных примеров: 2-фуранилметантиол с ароматом свежеобжаренного кофе, 2-ацетил-2-тиазолин в аромате запеченного мяса и т.д.

Реакция Майяра в мясных продуктах

Важное значение в образовании аромата и отчасти вкуса мясных продуктов при термической обработке, конечно же имеет реакция Майяра. Так, как мясные продукты содержат много аминокислот, то под действием высоких температур происходит реакция взаимодействия между аминогруппами свободных аминокислот, полипептидов и карбоксильными группами углеводов (сахаров).

В результате образуются промежуточные продукты, обуславливающие появление характерного запаха — карбонильные соединения (альдегиды, кетоны, летучие кислоты), серосодержащие соединения и др. Конечными продуктами этих реакций являются меланоидины — полимеры темно-коричневого цвета – корочка на мясных продуктах.  При нагревании мяса протекает реакция Майяра , а присутствие серосодержащих аминокислот цистеина и метионина приводит к образованию компонентов, имеющих сильный аромат. Следовательно, карбонильные соединения, такие как оксопропанол и метилфурфураль, являющиеся продуктами реакции Майяра, играют очень значительную роль в формировании вкуса приготовленного мяса.

Интенсивность образования меланоидинов и их промежуточных продуктов зависит от температуры и продолжительности воздействия теплоты. Поэтому в наиболее наглядной форме последствия этой реакции проявляются при стерилизации, запекании и жарении.

 Влияние реакции на пищевую ценность

Несмотря на активизацию деятельности рецепторов, меланоидины отнимают некоторое количество аминокислот. При протекании реакции аминокислоты и сахара переходят в другие вещества, которые не несут никакой пищевой ценности. Но не стоит забывать и о светлой стороне: благодаря меланоидинам у человека вырабатывается желудочный сок и появляется желание съесть продукт. В этом отношении все относительно: лучше потерять небольшое количество пищевой ценности и получить большое желание съесть, чем сохранить минимальное количество аминокислот и приготовить блюдо с минимальными вкусовыми характеристиками.

Все о жарке и ее разновидностях

Кроме классической жарки есть менее известные нам разновидности: татаки, пассерование, подпекание.

🔥 Татаки или опаливание — японский способ приготовления мяса или рыбы на открытом огне. Мясо быстро обжаривается и маринуется в уксусе, после чего режется слайсами и подается. Получается аппетитное блюдо с ярким ароматом, но вот дома его приготовить непросто.

🏡 Дома. Можно попробовать опалить мясо горелкой — но будьте осторожны! Также можно опаливать десерты, посыпать сахаром и глазировать овощи, плавить сыр — возможностей масса, не бойтесь экспериментировать.

🥡 Стир-фрай или вок — техника быстрого обжаривания еды в большом количестве масла. Во время такой жарки продукты как карамелизируются, так и происходит реакция Майяра. Чтобы блюдо не сгорело, его постоянно помешивают, а также подбрасывают содержимое в воздух, чтобы охладить его. Сегодня вок чаще всего используют в азиатской кухне, изначально он появился в кантонской кухне Китая.

🏡 Дома. Приготовить дома вок сложно: для этого нужна глубокая сковорода и специальная углубленная жарящая поверхность — сковорода должна быть сильно разогрета со всех сторон. Несмотря на большое количество масла и высокую температуру, еда получается полезной, ведь готовится она очень быстро.

🥕 Пассерование знакомо всем нам по борщу: для него мы обжариваем морковь и свеклу на невысокой температуре. При пассеровании мы не поднимаем температуру выше 120 °C (примерно ⅔ мощности плиты) и жарим в небольшом количестве жира. Прием помогает раскрыть вкусы и ароматы, сохранить пользу продуктов, а также передать цвет продукта в масло. Также он меняет текстуру продуктов — они становятся мягче. Пассеруют не только овощи, но и муку — после обжарки с маслом она не образует комочков. Так что когда вы обжариваете лук перед тем, как добавить остальные ингредиенты, — вы пассеруете.

🏡 Дома. Для пассерования овощей используйте сковороду с толстым дном, лучше чугунную, — так овощи не подгорят. Овощи нужно нарезать мелкими и одинаковыми кусочками, чтобы время приготовления, например, для морковки и лука было одинаковым. Сначала надо закинуть коренья: сначала морковь, потом корень сельдерея, потом лук, потом томатная паста. Масло нужно добавлять 1:10 — сто миллилитров масла на килограмм продукта.

🧨 Подпекание — кратковременная обжарка без масла на высокой температуре. При подпекании главная цель — обуглить продукт и провести ту самую реакцию Майяра. Такой метод нужен для того, чтобы добавить яркого вкуса и дымного аромата в блюдо.

🏡 Дома. Сильно разогрейте сухую сковороду или даже просто электрическую конфорку и обожгите на ней нужный продукт. Например, можно подпечь болгарский перец перед тем, как добавить его в салат. Также очень вкусно подпалить лаваш или хлеб и подать к еде.

👨🏻‍🍳 Совет шефа. Попробуйте обуглить лук и добавить его в мясной бульон — лук притянет к себе хлопья белка и бульон получится прозрачным.

Что такое реакция Майяра и как она происходит?

Золотисто-коричневая индейка, жареные ребра красно-коричневого цвета, кренделя шоколадно-коричневые … Их цвет и аромат в значительной степени происходят от химической реакции, названной в честь врача из Франции Луи-Камиля Майяра.

Что такое реакция Майяра, как она происходит и почему так важна для мира кулинарии? Сегодня попытаемся дать ответ на эти вопросы и рассказать все об этой реакции.

Что такое реакция Майяра и как она происходит?

Реакция Майяра — это химическая реакция, которая происходит в процессе нагревания продуктов между аминокислотами и сахарами. Например: В процессе нагревания пищи (будь то обжаривание мяса или выпекание хлеба) появляется корочка золотистого или коричневого цвета, а также блюдо приобретает особый вкус и аромат.

Основным продуктом реакции Майяра есть меланоидины — темноокрашенные пигменты, благодаря которым продукт получает свой цвет (именно поэтому этот процесс еще называют реакцией меланоидинообразования). Также в реакции участвуют фураны, фураноны, пиразины и т.д. Эти побочные продукты реакции отвечают за формирование вкуса и аромата блюда.

Температура имеет значение?

Реакция Майяра также может проходить и при комнатной температуре, но на это уйдет много месяцев. Когда температура достигает отметки выше 105С, скорость реакции значительно ускоряется. Если же вы хотите достичь такого же результата, готовя при низкой температуре, нужно готовить значительно дольше.

К сожалению, даже если вы будете готовить 5 или 6 часов стейк в сувиде или же варить бульон для фо на протяжении всеей ночи, вы не сможете достичь необходимого результата, ведь даже такого промежутка времени мало, если температура ниже 105С. Но, при этом, обжаривание костей и овощей для демигляса нужна как раз для того, чтобы накопить продукты реакции Майяра, которые будут концентрироваться при дальнейшем уваривании. При значительном выпаривании воды в  демиглясе, температура будет повышаться, значит реакция Майяра будет продолжаться.

Когда температура достигнет отметки выше 160С, к реакции Майяра присоединится также процесс карамелизации, что усилит цвет и аромат продукта.

Можно ли контролировать этот процесс?

Вы можете контролировать реакцию Майяра, изменяя количество восстановительных сахаров и наличие аминокислот. Понижающие сахара включают глюкозу, фруктозу, лактозу, мальтозу и более экзотические сахара, такие как рибоза. Добавление одного из этих восстановительных сахаров на поверхность усилит реакцию и может улучшить вкусовой профиль.

Вы также можете усилить реакцию, увеличивая рН, поскольку это делает аминокислоты более доступными для реакции. Поэтому щепотка соды при карамелизации лука сэкономит ваше время и придаст сладких, карамельных ноток. А темно-коричневая кожа кренделя происходит от мытья щелочи (что очень основным), что усиливает реакцию Майяра.

Жир имеет значение

Жареные ребра и баранья нога получают свой запах и вкус благодаря реакции Майяра. Но, если бы вы удалили весь жир из мяса или морепродуктов, вы все равно чуствовали бы мясной или рыбный вкус, но ароматы, отличающие один продукт от другого, исчезли бы. Это одна из многих причин, почему люди так ценят мраморное мясо и жирную рыбу.

Кстати, на нашем Базовом кулинарном курсе есть уроки пищевой химии, где студентам просто и легко объясняют о всех реакциях, которые происходят на кухне. Хотите узнать больше? Переходите ЗДЕСЬ

Наука о подрумянивании, аромате и вкусе

Если вы регулярно читаете Serious Eats, то наверняка видели, как мы снова и снова ссылаемся на реакцию Майяра. Это потому, что реакция Майяра отвечает за подрумянивание, сложный вкус хлеба, придающий хлебный вкус тостовому и солодовому, гамбургеры — обугленный, а кофе — темный и крепкий. Если вы планируете готовить сегодня вечером, скорее всего, вы воспользуетесь реакцией Майяра, чтобы превратить сырые ингредиенты в лучший сенсорный опыт.

Но реакция Майяра не только делает пищу восхитительной. Понимание реакции, даже на поверхностном уровне (это каламбур Майяра, и вы скоро полностью это поймете), это ключ к пониманию химических и физических процессов приготовления. Понимание задействованных переменных и обучение тому, как ими манипулировать, — один из лучших способов стать более уверенным поваром — это разница между рабством рецепта и свободой заставить рецепт работать на вас.

Хорошая новость в том, что реакция Майяра присутствует повсюду, а это значит, что у нее есть много шансов попрактиковаться и научиться.Мы используем его так часто, что его легко забыть, но когда он отсутствует, вы обязательно заметите. Представьте себе стейк, который на вкус вареный, а не жареный, или жаркое, которое по вкусу больше похоже на пар. Каждый из них представляет собой упущенную возможность использовать потенциал реакции Майяра.

Итак, что такое реакция Майяра?

Фотография: Х. Кенджи Лопес-Альт.

Реакция Майяра сложна. На самом деле настолько сложен, что только в последние несколько лет ученые начали выяснять, что это такое на самом деле.Хотя они все еще не совсем понимают это, они знают основы: Реакция Майяра — это множество небольших одновременных химических реакций, которые происходят, когда белки и сахара в вашей пище и на ней преобразуются под действием тепла, производя новые вкусы, ароматы и цвета.

Фактически, реакция Майяра делает пищу более привлекательной для нас, людей, побуждая нас закусить стейком, выпить кофе или выпить пиво. сырая коровья лопатка особенно аппетитна.Но если эту же мышцу измельчить, превратить в котлеты и прижарить на плоской поверхности, мы с нетерпением выстроимся в очередь вокруг блока. В значительной степени это потому, что мы эволюционировали, чтобы реагировать на два важных сигнала при встрече с пищей. Первый — это сигнал о питании, который говорит нам, что пища содержит изрядную дозу легкоусвояемых калорий, витаминов и минералов. Второй — сигнал «общей безвредности», который говорит нам, что еда нас не убьет. Реакция Майяра — это эволюционный способ объединения этих двух сигналов в один суперсигнал, специфичный для жареного или коричневого вкуса приготовленной пищи.

* Да, даже пиво подвергается реакции Майяра — когда зерна обжариваются перед варкой.

Все, что мы ищем в кулинарии, — это, по сути, процесс нагревания пищи в течение определенного периода времени. Если все идет хорошо, вы также проголодаетесь. Если расширить наш пример, бургер состоит из базового набора строительных блоков: белков, сахара и воды. Реакция Майяра — это то, что может случиться с этими белками и сахарами, когда к уравнению добавляются тепло и время.

Короче говоря: при правильном количестве тепла, влаги и времени эти специфические сахара и белки будут действовать как пара пьяных любовников, целующихся на заднем сиденье Chevy, быстро превращаясь в запутанный горячий беспорядок, пока … девять месяцев спустя появляется совершенно новое творение. За исключением того, что с белками и сахарами это занимает минуты, а не месяцы, и вместо ребенка в результате получается все более сложный набор молекул вкуса и аромата, а также более темный цвет благодаря недавно образованным молекулам съедобного пигмента, называемым меланоидинами.

Тепло, влажность и время

Фотография: Х. Кенджи Лопес-Альт.

Первое, что вам нужно для реакции Майяра, — это тепло. Стейк, оставленный на прилавке на неделю при комнатной температуре, безусловно, претерпит некоторые химические изменения, но Майяр не будет одним из них.

Тем не менее, этому стейку нужно не просто нагревание — ему требуется относительно высокий уровень его нагрева, если вы хотите, чтобы поверхность подрумянилась. Кипящая вода, максимальная температура которой достигает 212 ° F (100 ° C) на уровне моря, не является достаточно жарко.Вот почему отварной стейк становится серым, а не темно-коричневым, никого не возбуждая.

Maillard может работать с при более низких температурах и с большим количеством воды. Если вы готовите куриный, говяжий или овощной бульон на медленном огне в течение восьми или 12 часов, в результате все равно остается коричневая ароматная жидкость — мертвая расплата за то, что произошло Майяра.

Но большинство из нас не готовят бульон так много часов, и никто из нас не варит стейк примерно столько времени.Вместо этого мы жарим, жарим и готовим на гриле. Эти процессы приготовления происходят относительно быстро, в считанные минуты, а не часы, и для того, чтобы процесс приготовления Майяра происходил быстро, нам необходимо отвести достаточно влаги, чтобы вырваться из этой крышки 212 °.

Приготовив стейк на раскаленной сковороде, вы можете полностью обезвожить его поверхность, чтобы температура на этой поверхности поднялась до уровня выше 300 ° F (149 ° C). В этот момент реакция Майяра задействуется в полную силу, создавая новые вкусы, ароматы и характерные коричневые цвета, которые дают реакции ее более банальное название — «реакция потемнения».»

Вот почему может быть разумным решением промокнуть мясо насухо полотенцем или дать ему высохнуть в холодильнике в течение нескольких часов, прежде чем готовить. Вот почему вы должны солить мясо либо более чем за 45 минут до приготовления (давая достаточно времени, чтобы соль вытягивала влагу через осмос из мяса, которая затем реабсорбирует этот соленый рассол, делая мясо более нежным и влажным), либо непосредственно перед (что позволяет избежать значительной потери влаги из-за осмоса).В идеале у вас будет достаточно времени, чтобы объединить эти две вещи, используя технику, называемую засаливанием: обильно посолив мясо, а затем дайте ему высохнуть на воздухе в холодильнике, по крайней мере, на ночь и до нескольких дней перед приготовлением. В конечном итоге вы получите мясо, которое сильно приправлено, а также имеет хорошо высушенную поверхность, идеально подготовленную для максимальной температуры Майяра после жарки или обжарки.

Белки и сахара

Фотография: Вики Васик.

Тепло, влажность и время могут быть ключевыми факторами в реакции Майяра, но без белков и сахаров этого просто не произойдет.Белки — это длинные цепочки аминокислот, скомканные, как комки бумаги. Некоторые из них восприимчивы к Майяру, что означает, что они действительно любят связываться с сахаром. Но подойдет не любой сахар. Молекулы сложных сахаров, таких как крахмал или столовый сахар, слишком велики, чтобы вступать в реакцию с белками Майяра. Вместо этого эти белки требуют «восстанавливающих сахаров», которые по сути являются простыми сахарами, притягивающими аминокислоты при определенных уровнях влажности и температуры.

Это критический момент: реакция Майяра начинается с несколько ограниченного набора белков и молекул сахара, и, поскольку они связываются и смешиваются с течением времени, в уравнение добавляется все больше и больше новых молекул.Если задуматься, это своего рода кровосмесительная молекулярная оргия. (Грубо! А еще … конфетка!) Эти беспорядочные молекулы смешиваются и сопоставляются снова и снова, миллиарды и триллионы раз в секунду, на поверхности пищи, образуя растущий, рекурсивный, рекомбинантный двигатель аромата и вкуса.

На этот двигатель влияют температура, время и pH — все, что могут контролировать домашние повара. Если вы хотите получить много вкусовых и ароматических соединений, просто немного повысьте pH с помощью пищевой соды (как это делает Кенджи, чтобы приготовить быстро карамелизованный лук для своего французского лукового супа в скороварке).Ищете хрустящую подрумяненную корочку? Просто понизьте pH с помощью небольшого количества кислоты или увеличьте температуру. Хотите и того, и другого? Жарение на жирах дает вам лучшее из обоих миров.

Но … почему нам это нравится?

Фотография: Х. Кенджи Лопес-Альт.

Давайте на мгновение подумаем о скромной картошке. Большинство из нас согласятся, что сырой картофель довольно непривлекателен. Конечно, вы можете съесть сырой картофель, и это не повредит вам — в конце концов, это просто большой кусок концентрированного крахмала, а крахмал — это энергия, необходимая для нашего выживания.Но, благодаря перипетиям нашей эволюции, мы, люди, больше не можем эффективно переваривать эту сырую окорочку. Наша пищеварительная система будет изо всех сил пытаться расщепить сложные крахмалы картофеля на более простые, и ей не удастся извлечь многие из питательных веществ, скрытых внутри. Приготовление пищи разрушает крахмал и высвобождает эти питательные вещества, улучшая их способность усваиваться нашим организмом.

Когда мы разрезаем картофель, а затем жарим его, происходит последовательность событий. Во-первых, вода на открытых поверхностях в основном выкипает, превращая крахмалы в пушистую массу и превращая их в более простые сахара.По мере того, как тепло на этих поверхностях увеличивается из-за потери воды, белки и расщепленные сахара начинают еще больше расщепляться, а затем рекомбинировать. Знакомый бледно-коричневый цвет появляется на поверхности каждого ломтика картофеля. Некоторые из различных молекул протеина и сахара, образовавшихся на поверхности уже приготовленного картофеля, поднимутся в горячий воздух над сковородой и направятся к вашему носу. Этот запах жареного картофеля говорит вашему организму, что есть пища, которая может обеспечить его питательными веществами, в которых он не только нуждается, но и может легко использовать.Откусите, и ваш рот подтвердит, что это вкусно.

Теперь я вижу, что некоторые из вас сзади говорят: «Погодите-ка, мне больше всего нравится пюре, и это совсем не Майяр!» Вы обращаете внимание на одно важное замечание: вареный и приготовленный на пару картофель из-за большого количества воды, присутствующей во время этих относительно коротких процессов приготовления, не подвергается реакции Майяра, но все же может давать восхитительные результаты. Однако я бы сказал, что этот картофель только действительно становится вкусным, если его смешать с каким-либо другим источником вкуса и аромата, например, маслом.Основная ароматическая молекула масла называется масляной кислотой, а бутираты, как оказалось, также являются первичными ароматическими молекулами, производимыми реакцией Майяра при жарке мяса. Почти всегда путь ведет обратно к реакции Майяра.

Майяр — это больше, чем просто Майяр

Фотография: Вики Васик.

Вот следующее, что вам нужно знать: реакция Майяра — не единственная реакция, которая может произойти с этими строительными блоками из белка, сахара и воды, и, в зависимости от соотношения этих строительных блоков, вы можете получить различные эффекты. самой реакции Майяра.

Например, тесто для печенья состоит из тех же строительных блоков, что и стейк. Что отличает их, так это пропорции: в стейке, очевидно, намного больше белка, а в печенье намного больше сахара. Это оказывает сильное влияние не только на то, как происходит реакция Майяра, но и на то, в какой степени эти продукты испытывают другие связанные реакции, такие как карамелизация.

Карамелизация — это то, что происходит, когда сахар нагревается и начинает реагировать с водой в процессе, известном как гидролиз, расщеплении и преобразовании в сложное, сладкое, ореховое и слегка горькое вещество, известное как…карамель. Мне нравится думать о карамелизации как о двоюродном брате реакции Майяра. Когда уровень белка низкий, уровень сахара высокий, а температура к северу от 350 ° F (177 ° C) — как, например, в партии печенья, выпекаемой в духовке, — карамелизация становится гораздо более важным фактором. Как и реакция Майяра, карамелизация также дает более темный цвет и более сложный аромат, что является одной из причин, по которым их часто принимают друг за друга.

Имейте в виду, что эти реакции, хотя и разные, не исключают друг друга.Как реакция Майяра, так и карамелизация могут иметь место и имеют место как в стейке, так и в печенье, но они производят заметно разные, часто дополняющие друг друга, вкусы и ароматы каждого из них.

Стейк состоит из мускулов, состоящих в основном из белка и воды и сравнительно небольшого количества сахара; высокая концентрация белка приводит к реакции Майяра, которая дает больше ароматических молекул и меньше ароматических. С другой стороны, печенье — это противоположность: при большом количестве сахара и относительно небольшом количестве белка реакция Майяра дает больше ароматических соединений и меньше ароматических молекул.

С другой стороны, поскольку печенье содержит больше сахара, оно также подвергается более сильной карамелизации, что придает аромат, которого не было в реакции Майяра. В стейке, тем временем, не хватает ароматов, произведенных Майяром, но, к счастью, аромат его слегка подгоревшего жира делает свое дело, привнося аромат, которого в противном случае ему могло бы не хватить. Возможность использовать оба этих процесса может помочь нам создавать более вкусные блюда.

Мой дедушка говорил, что приготовление только по рецептам никогда не дало бы нам волшебства, которое представляет собой курица и вафли.Конечно, рецепт может показать вам, как приготовить каждый по отдельности, но эксперименты научили нас тому, что объединение обоих вместе вкуснее. Знание реакции Майяра показывает, что мой дед был даже более прав, чем он думал. Курица и вафли так хорошо сочетаются друг с другом, потому что представляют собой идеальное сочетание различных реакций Майяра. В вафлях — это сахар Майяра с высоким ароматом и низким вкусом; в курице с высоким содержанием белка все наоборот. Вместе, намазанные кленовым сиропом (привет, карамелизация!), Вы получите идеальную научную еду, которую просто необходимо съесть.

Это еще одно напоминание о том, что кулинария — это просто съедобная наука: реакция Майяра — это наш интересный фундамент, рецепты наших экспериментов, а вы, наш ученый, чье существование, удовлетворение и, в конечном счете, выживание зависят от результатов.

Что такое реакция Майяра

Изображение слева: Куриная грудка с морковью, приготовленная при 200F, Изображение справа: Куриная грудка с морковью, приготовленная при температуре выше 300F

Браунинг, или реакция Майяра, придает блюдам вкус и изменяет их цвет.Реакции Майяра обычно начинаются только при температуре выше 285 ° F (140 ° C). Пока не наступит реакция Майяра, мясо будет иметь меньший вкус. Выше показаны два идентичных блюда, приготовленные (слева) при температуре ниже (140 ° C), а справа — при гораздо более высокой температуре. И карамелизация, и реакция Майяра происходят только справа, давая заметный коричневый цвет.

Реакция Майяра — это химическая реакция между аминокислотой и редуцирующим сахаром, обычно требующая добавления тепла.Как и карамелизация, это форма неферментативного потемнения. Реактивная карбонильная группа сахара взаимодействует с нуклеофильной аминогруппой аминокислоты, в результате чего возникают интересные, но плохо охарактеризованные молекулы запаха и вкуса. Этот процесс ускоряется в щелочной среде, потому что аминогруппы не нейтрализуют. Эта реакция является основой индустрии ароматизаторов, поскольку тип аминокислоты определяет получаемый аромат.

В процессе создаются сотни различных ароматизаторов.Эти соединения, в свою очередь, распадаются с образованием новых ароматических соединений и так далее. Каждый тип пищи имеет очень характерный набор ароматических соединений, которые образуются во время реакции Майяра. Это те же самые соединения, которые ученые-ароматизаторы использовали на протяжении многих лет для создания искусственных ароматизаторов.

Не следует путать реакцию Майяра с карамелизацией, происходящей с сахарами.

Хотя эта реакция использовалась с древних времен, она названа в честь химика Луи-Камиля Майяра, исследовавшего ее в 1910-х годах.

Продукты с реакциями Майяра

Реакция Майяра отвечает за многие цвета и вкусовые качества пищевых продуктов:

• карамель из молока и сахара
• подрумянивание хлеба в тосты
• цвет пива, шоколада, кофе и кленового сиропа
• средства для автозагара
• аромат жареного мяса
• цвет сухого или сгущенного молока

6-ацетил-1,2,3,4-тетрагидропиридин (1) отвечает за запах печенья или крекеров, присутствующий в выпечке, такой как хлеб, попкорн, тортилья.Структурно родственное соединение 2-ацетил-1-пирролин имеет аналогичный запах, а также встречается в естественных условиях без нагревания и придает аромат разновидностям вареного риса. Оба соединения имеют порог запаха ниже 0,06 нг / л [1].

Процесс

1. Карбонильная группа сахара реагирует с аминогруппой аминокислоты с образованием N-замещенного гликозиламина и воды
2. Нестабильный гликозиламин подвергается перегруппировке Амадори, с образованием кетозаминов
3. Кетозамины могут реагировать несколькими способами:
   • Производство 2 воды и редуктонов
   • Могут образовываться диацетил, аспирин, пирувальдегид и другие продукты короткоцепочечного гидролитического деления
   • Производство коричневых азотистых полимеров и меланоидинов

Ключевые факторы

Пентозные сахара реагируют больше, чем гексозы, которые реагируют больше, чем дисахариды.

Различные аминокислоты вызывают различное потемнение.

Поскольку в результате реакции Майяра образуется вода, наличие среды с высокой активностью воды ингибирует реакцию.

См. Также:

Как влияет приготовление пищи на реакцию Майяра

Почему красное мясо становится коричневым при закрытии вакуума.

Важные температуры при приготовлении пищи

Наука приготовления под давлением

Внешние ссылки

Список литературы

Исследование патогенеза хронических заболеваний

Abstract

Реакция Майяра, начиная с гликирования белка и прогрессируя до образования конечных продуктов гликирования (AGE), также вовлечена в развитие осложнений сахарного диабета. как в патогенезе сердечно-сосудистых, почечных и нейродегенеративных заболеваний.В этом перспективном обзоре мы даем обзор значимости реакции Майяра в патогенезе хронических заболеваний и обсуждаем традиционные подходы и недавние разработки в области анализа гликозилированных белков с помощью масс-спектрометрии. Мы предполагаем, что подходы протеомики, особенно восходящей протеомики, будут играть важную роль в анализе клинических образцов, ведущем к идентификации новых маркеров развития и прогрессирования заболевания.

ВВЕДЕНИЕ

В 1912 году французский ученый Луи-Камиль Майяр (1878–1936) опубликовал статью, в которой описывалась реакция между аминокислотами и восстанавливающими сахарами во время нагревания, что привело к обесцвечиванию (потемнению) реакционной смеси. ¹ Эта сеть реакций между аминокислотами и редуцирующими сахарами стала известна как реакция Майяра. В течение следующих 60 с лишним лет работа над реакцией Майяра была сосредоточена на продуктах питания и пищевых модельных системах, и реакция Майяра была признана важным членом группы реакций потемнения, которые имеют место в продуктах питания и напитках. Эта сложная реакция происходит не только практически во всех пищевых продуктах, подвергающихся тепловой обработке и хранению, но также в бумажной, ² текстильной, ² и биофармацевтической отраслях. ^{3 — 5} Кроме того, он играет роль в образовании гуминовых веществ в почве. ² Однако реакции Майяра in vivo стали уделять значительное внимание только с 1970-х годов. В организме гликирование — реакция глюкозы или продуктов ее автоокисления с аминами, аминокислотами, пептидами и белками — обычно считается первым шагом в этой сложной реакции. Более поздние стадии реакции приводят к образованию белковых аддуктов и сшивок, полученных из сахара, известных как конечные продукты гликирования (AGE).В этом перспективном обзоре мы даем обзор значимости реакции Майяра в патогенезе хронических заболеваний и обсуждаем традиционные подходы и последние разработки в области анализа гликозилированных и AGE-модифицированных белков с помощью масс-спектрометрии.

История и обзор реакции Майяра

Реакция Майяра включает сложную сеть реакций; это не типичная органическая «названная реакция», и ее трудно кратко резюмировать. Тем не менее, американский ученый Джон Ходж (1914–1996) в своем основополагающем обзоре реакции Майяра, ⁶ построил диаграмму (), которая пытается упростить реакционную сеть; эта диаграмма по-прежнему актуальна и широко цитируется.Исходная схема Ходжа делит реакцию Майяра на 7 шагов (A – G). В 1986 году Нурстен признал работу японских ученых, Намики и соавторов, ^{7 , 8} относительно свободнорадикальной деградации промежуточных продуктов Майяра, добавив Шаг H к исходной схеме (). ⁹ Стадия H также известна как путь Намики и включает в себя опосредованное свободными радикалами образование продуктов расщепления карбонила из восстанавливающего сахара. ^{7 , 8}

Диаграмма Ходжа

A) Начальная реакция между восстанавливающим сахаром и аминогруппой образует нестабильное основание Шиффа; Б) База Шиффа медленно перестраивается с образованием продукта Амадори; C) деградация продукта Amadori; Г) образование реакционноспособных карбонильных и дикарбонильных соединений; E) образование альдегидов Штрекера из аминокислот и аминокетонов; F) Альдольная конденсация фурфуролов, редуктонов и альдегидов, полученных на стадиях C, D и E, без вмешательства аминосоединений; G) реакция фурфуролов, редуктонов и альдегидов, полученных на стадиях C, D и E, с аминосоединениями с образованием меланоидинов; H) Опосредованное свободными радикалами образование продуктов расщепления карбонила из редуцирующего сахара (путь Намики). ^{7 , 8} Воспроизведено из Trends in Food Science and Technology, 1, Ames JM, Control of the Maillard response in food systems, pp. 150–154, 1990, с разрешения Elsevier.

Начальная стадия реакции Майяра (стадия A) включает конденсацию карбонильной группы, например, из редуцирующего сахара, такого как глюкоза, со свободной аминогруппой, обычно эпсилон-аминогруппой остатков лизина в белках. Эта реакция гликирования приводит к образованию нестабильного основания Шиффа (альдимина), которое спонтанно перестраивается (, стадия B) с образованием более стабильной 1-амино-1-дезокси-2-кетозы (кетоамина), которая также известна как Amadori product () в честь итальянского ученого Марио Амадори. ¹⁰ Когда исходным сахаром является глюкоза, продукт Амадори обычно известен как фруктозелизин (FL). Константа равновесия для образования продукта Амадори находится в сильном прямом направлении при физиологическом pH, ² , но обратимость возрастает с увеличением pH, а также в присутствии фосфата. ²

Реакция между глюкозой и аминогруппой белка с образованием продукта Амадори

Нуклеофильная атака свободной аминогруппой белка на альдегид глюкозы сначала образует карбиноламин, который впоследствии дегидратируется до основания Шиффа.Затем основание Шиффа подвергается медленной перегруппировке с образованием продукта Амадори. Хотя показана только одна циклическая изоформа продукта Amadori, важно отметить, что она существует в виде смеси нескольких изоформ.

Продукты Amadori разлагаются различными путями (, стадии C и D), ^{11 , 12} , что приводит к образованию фурфуролов, редуктонов и продуктов фрагментации (карбонильных и гидроксикарбонильных соединений). Все эти промежуточные соединения могут также образовываться непосредственно из сахара в некаталитических реакциях, т.е.е. без вмешательства аминосоединения (). На стадии C образование фурфурола благоприятно в кислых условиях, в то время как щелочная среда способствует образованию редуктонов. Эти промежуточные соединения конъюгированного эндиола обладают умеренной восстанавливающей способностью; они могут катализировать окислительно-восстановительные реакции, зависящие от рециркуляции переходных металлов (например, Fe, Cu), но, как и аскорбат, они также могут способствовать антиоксидантной активности.

Фрагментация сахара (, стадия D) происходит в основном за счет ретроальдолизации. α-дикарбонильные соединения, напр.например, бутандион, глиоксаль, метилглиоксаль, образующиеся на стадии D, способны реагировать с аминокислотами через деградацию Стрекера (, стадия E) (названная в честь немецкого химика Адольфа Стрекера) с образованием альдегидов Стрекера аминокислот и аминокетонов; последние впоследствии конденсируются с образованием пиразинов. Альдегиды и пиразины Стрекера придают аромат разогретой пище.

Шаги F и G суммируют заключительную стадию реакции Майяра, и именно здесь образуется большинство соединений, придающих цвет.Это могут быть относительно небольшие молекулы или полимерные материалы гораздо большего размера. ^{13 , 14} Стадия F включает альдольную конденсацию фурфуролов, редуктонов и альдегидов, полученных на стадиях C, D и E, без вмешательства аминосоединений. Стадия G представляет реакции между теми же промежуточными продуктами с аминосоединениями, которые приводят к конечным продуктам реакции, известным в пищевой науке как меланоидины. Эти плохо определенные соединения хелатируют окислительно-восстановительные ионы переходных металлов и, таким образом, обладают антиоксидантной активностью.Ходж определил меланоидины как «коричневые азотистые полимеры и сополимеры». ⁶ Полимеры обычно считаются содержащими повторяющиеся звенья, но, поскольку структура меланоидинов неизвестна и присутствие истинных повторяющихся звеньев не определено, меланоидины иногда в более общем виде описываются как макромолекулярные материалы.

Роль реакции Майяра в качестве пищевых продуктов

Подавляющее большинство исследований и характеристик реакции Майяра до 1980-х годов было основано на исследованиях, проведенных учеными-диетологами по вкусу, цвету, текстуре, усвояемости и питательной ценности пищевых продуктов. на эти свойства в значительной степени влияет реакция Майяра, и ими можно управлять, изменяя состав пищи, обработку или условия хранения.С 1980-х годов работа биомедицинских лабораторий (см. Ниже) оказала огромное влияние на знания в этой области, в то время как вклад химиков-пищевых химиков не ослабевает.

Реакция Майяра изменяет питательную ценность пищи, особенно в результате реакций с участием е-аминогруппы остатков лизина в белке (лизин необходим с питательной точки зрения). Кроме того, после окисления до дегидроаскорбиновой кислоты витамин С (аскорбиновая кислота) может реагировать со свободными аминогруппами вместо редуцирующего сахара, что приводит к потере этого витамина.Кроме того, важные для питания металлы, такие как медь, цинк и железо, могут образовывать комплексы с продуктами реакции Майяра, включая продукты Амадори и меланоидины. ¹⁵ Наконец, реакция Майяра может привести к снижению питательной ценности пищи из-за сшивки белков, опосредованной узнаваемыми AGE или другими связанными с пептидами аддуктами, такими как те, которые вносят вклад в цвет.

Реакция Майяра также ответственна за увеличение антиоксидантной активности в пищевых системах, включая кофе ^{16 , 17} и солод. ^{18 , 19} Как редуктоны, так и меланоидины могут способствовать антиоксидантной активности, и их образование может продлить срок хранения пищевых продуктов за счет ингибирования окислительных реакций, которые приводят к прогорклости и неприятному запаху. Кроме того, реакция Майяра может приводить к образованию акриламида в продуктах питания, чему в последние шесть лет уделялось много внимания. ²⁰

Роль реакции Майяра в биофармацевтике

В настоящее время все моноклональные антитела, одобренные Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, производятся из культуры клеток млекопитающих. ⁵ В течение 10–14-дневного процесса культивирования клеток, необходимого для продукции антител, белки инкубируются с большим молярным избытком редуцирующего сахара на моль белкового продукта. Высокая концентрация редуцирующего сахара обеспечивает клетку энергией, а также средством модуляции ферментативного гликозилирования. Таким образом, модификация белкового продукта редуцирующим сахаром во время культивирования клеток весьма вероятна и может поставить под угрозу фармацевтическую активность терапевтических антител и белков. ^{4 , 5}

В качестве альтернативы модификация белка может происходить во время последующих стадий составления, упаковки, длительного хранения или клинического введения, когда сахара обычно используются в качестве наполнителей в жидких или лиофилизированных составах терапевтических белков. ^{3 — 5 , 21 — 26} Например, было описано, что составы, содержащие сахарозу, со временем потемнеют, что, вероятно, считается результатом реакций типа Майяра. ²⁷ Хотя сахароза является невосстанавливающим дисахаридом, она может подвергаться гидролизу — например, при низком pH — к глюкозе и фруктозе.

Таким образом, модификация терапевтических белков путем восстановления сахаров может изменить их заряд, способность связывания мишени и скорость разложения. ⁴ Это, в свою очередь, может привести к снижению эффективности и стабильности и повышению токсичности. В частности, стабильность белка является серьезной проблемой при разработке био-терапевтических средств, поскольку для вывода этих продуктов на рынок необходимо поддерживать их через несколько этапов обработки.

ГЛАВНАЯ РЕАКЦИЯ

IN VIVO

Хотя фруктоза и лактоза являются важными редуцирующими сахарами в пищевых продуктах, глюкоза является основным свободным сахаром в организме. Таким образом, гликирование белков глюкозой считается первым этапом реакции Майяра in vivo . Гликирование — это наиболее общий термин ИЮПАК для присоединения сахара к другой биомолекуле. Для белков гликозилирование часто используется в сочетании с гликозилированием, причем гликозилирование является неферментативным процессом, а гликозилирование — ферментативным процессом, образующим гликозидную связь.Иногда термины неферментативное гликирование и ферментативное гликозилирование используются для большей точности, но, как правило, термин гликирование не используется точно: он может относиться к образованию основания Шиффа и / или продукта Амадори к аминогруппе в белок; к присоединению дикарбонильных соединений, таких как метилглиоксаль, к аргинину; или к образованию AGE, включая как аддукты, так и поперечные связи. В следующем обсуждении мы определяем гликирование как неферментативную реакцию глюкозы с аминогруппами в белке с образованием продукта Амадори.

Гликирование гемоглобина

Интерес к гликированию в биологических системах начался с открытия и характеристики гемоглобина A _1c (HbA _1c , 4–6% общего гемоглобина) в конце 1970-х годов. Открытие было в некоторой степени случайным, поскольку образование продукта Амадори на аминоконцевом валиновом остатке в β-цепи (βV ₁ ) гемоглобина вызвало кислотный сдвиг в pKa белка; это привело к анионному сдвигу в подвижности белка в буферах для электрофореза, которые затем использовались для скрининга генетических вариантов гемоглобина.Хроматографическое фракционирование гемоглобина выявило ряд других анионных форм гемоглобина, которые также были гликированы по βV ₁ , включая HbA _1a1 (фруктоза-1,6-P ₂ , <1% общего гемоглобина), HbA _1a2 (глюкоза-6-P, <1% общего гемоглобина) и HbA _1b (пируват кетимин, <1% общего гемоглобина). ^{28 — 30} Также стало ясно, что имело место значительное гликирование остатков лизина в основной фракции гемоглобина A ₁ Hb; на самом деле их ~ 2.5 гликированных лизинов (FL) на остаток гликированного валина в общем Hb. ³¹ Гликирование остатков лизина не влияет на хроматографическую или электрофоретическую подвижность гемоглобина при pH 6–9. Сегодня термин HbA _1c используется в отношении конкретных видов, содержащих глюкозу на остатке βV ₁ . Термины гликированный гемоглобин или гликогемоглобин (GHb, GlcHb) относятся к полному спектру гликированных гемоглобинов, включая те, которые содержат остатки гликированного валина и / или лизина.

Кинетика и степень гликирования белков

Большинство исследований гликирования in vivo сосредоточено на измерении FL в гемоглобине, белках плазмы, кристаллинах, белках плазмы или белках внеклеточного матрикса (прежде всего коллагене). Эти белки доступны, обновляются относительно медленно, и продукты Amadori постепенно накапливаются на них. Гликация — это медленная реакция (около 0,2% Hb / день или 0,01% аминогрупп / день) при нормальной (5 мМ) концентрации глюкозы в крови. GlcHb составляет ~ 24% от общего гемоглобина в конце жизни эритроцитов (~ 120 дней), давая в среднем 12% GlcHb, включая 4% HbA _1c у нормогликемического человека. ³¹ Есть некоторые свидетельства различий в скорости гликирования белков — например, общая скорость гликирования альбумина оценивается примерно в 9 раз быстрее, чем у гемоглобина (Garlick and Mazer, 1983). Измерение как HbA _1c , так и гликированного альбумина можно использовать для определения долгосрочной и среднесрочной гликемии, соответственно. HbA _1c отражает концентрацию глюкозы в крови за предыдущие 6-8 недель, тогда как гликированный альбумин отражает то же самое за предыдущие 2-3 недели. ³² В качестве альтернативы измерение гликирования ApoB / LDL, короткоживущего белка плазмы, можно использовать для оценки средних концентраций глюкозы в крови за предыдущую неделю. ³²

Степень гликирования белков варьируется от следовых количеств FL в короткоживущих белках до 20-30% гликозилированного альбумина, ³³ гемоглобина (тетрамер) и коллагена (мономер), ^{34 , 35} , что составляет примерно 3-6 ммоль FL / моль Lys в этих белках.Существует небольшой градиент степени гликирования белков в зависимости от возраста; как для кожи, так и для суставного коллагена, например, гликирование увеличивается примерно с 5 ммоль FL / моль Lys в возрасте 20 лет до 7 ммоль FL / моль Lys в возрасте 70 лет. ^{34 , 35} среднее значение HbA _1c , от 3,8 до 4,4% в возрасте от 20 до 70 лет. ³⁶ Такое небольшое увеличение гликемии с возрастом обычно связывают со снижением толерантности к глюкозе (чувствительность к инсулину) и увеличением средней гликемии с возрастом.Таким образом, у здорового населения гликирование не зависит от возраста.

Конечные продукты с улучшенным гликированием (AGE)

Степень гликирования белка достигает устойчивого состояния, в зависимости от скорости образования продукта Амадори и скорости его обращения или превращения в другие продукты; существуют также дегликирующие ферменты, которые ограничивают гликирование внутриклеточных белков. ³⁷ Реакция неферментативного обратного гидролиза проста, высвобождая глюкозу и ее C-2-эпимерманнозу без особых последствий.Ферментативная обратная реакция включает фосфорилирование продукта Амадори с последующим высвобождением 3-дезоксиглюкозона. Напротив, прямые реакции являются более сложными, генерируя широкий спектр реакционноспособных карбонильных и дикарбонильных соединений, как свободных, так и связанных с белками, в неокислительных и окислительных (гликоксидативных) реакциях, аналогичных тем, которые происходят в пищевых системах во время приготовления пищи. Эти промежуточные продукты гликирования (IGP) могут затем реагировать с белками с образованием стабильных необратимых аддуктов и поперечных связей, известных как AGE.Здесь важно отметить, что в дополнение к традиционному определению гликирования как процесса, ведущего к образованию продукта Амадори, сегодня принято относиться к гликированию белков дикарбонильными соединениями. Однако в этом обзоре мы рассматриваем гликирование как реакцию между глюкозой и аминогруппами на белке, и мы сосредоточимся на продукте Амадори как на воротах к образованию IGP и AGE.

IGP () включают свободный гликолевый альдегид и дикарбонильные соединения, такие как 1- и 3-дезоксиглюкозоны (DG), метилглиоксаль (MGO) и глиоксаль (GO).Связанные с белком IGP включают производные 4,5-диоксопентозы и 5,6-диоксогексозы, что указывает на существенную подвижность карбонила вдоль углеводной цепи. ³⁸ Эти дикарбонильные соединения служат в качестве предшественников для более сложных поперечных связей AGE, таких как пентозидин и глюкозепан.

Типичные промежуточные продукты гликирования

Окислительное разложение продукта Амадори приводит к образованию широкого диапазона реакционноспособных карбонильных и дикарбонильных соединений. Эти промежуточные продукты гликирования (IGP) включают глиоксаль, метилглиоксаль, гликолевый альдегид, 3-дезоксиглюкозон, 1-дезоксиглюкозон, 4,5-диоксопентозу и 5,6-диоксогексозу.Эти IGP также могут быть получены путем автоокисления глюкозы или, в случае глиоксаля и метилглиоксаля, путем перекисного окисления липидов.

AGE () включают аддукты к белку, такие как N ^ε — (карбоксиметил) лизин (CML), N ^ε — (карбоксиэтил) лизин (CEL) и пирралин, а также внутри- и меж- молекулярные сшивки, такие как соединения пентозидина, глюкозепана и имидазолия; ³⁹ среди них глюкозепан является основной сшивкой Майяра, образующейся в белках. ⁴⁰ Все эти модификации включают остатки лизина и / или аргинина, а также α-аминогруппу в белках. S — (карбоксиметил) цистеин (CMC) также был идентифицирован в белках; он присутствует примерно на том же уровне, что и ХМЛ в мышечном белке, ⁴¹ , но никаких других S-AGE идентифицировано не было. Из-за их кислотной стабильности ХМЛ и пентозидин являются наиболее часто измеряемыми AGE. Несмотря на то, что эти два соединения различаются более чем в 100 раз по своим концентрациям в белках, их концентрации сильно коррелируют друг с другом и с концентрациями других AGE в тканевых белках.

Типичные конечные продукты усовершенствованного гликирования

Окислительное разложение продукта Амадори или реакция тканевых белков с реактивными карбонильными и дикарбонильными соединениями может привести к образованию конечных продуктов усовершенствованного гликозилирования (AGE). AGE включают N ^ε — (карбоксиметил) лизин (CML), N ^ε — (карбоксилэтиллизин) (CEL), S — (карбоксиметил) цистеин (CMC), пирралин, производное 3-дезоксиглюкозона. сшивка имидазолием (DOGDIC), пентозидин, глюкозепан, димер глиоксаля лизина (GOLD), кросслайны и фторсвязь.

К настоящему времени в тканевом белке идентифицировано более 20 AGE — большинство из них, если не все, также присутствуют в корке хлеба и кренделях. ⁴² Некоторые из этих соединений, такие как пирралин, пентозидин и глюкозепан, явно являются AGE — они имеют 5 или 6 атомов углерода, полученных исключительно из сахаров. Однако другие, такие как CML и CEL, производятся несколькими путями. ХМЛ, например, может быть образован окислительным расщеплением продукта Амадори или реакцией гликолевого альдегида или ГО с остатками лизина в белке.CML (и CEL) также образуются во время реакций перекисного окисления липидов и во время автоокисления аскорбата. Они не являются уникальными биомаркерами реакций гликирования и иногда описываются как AGE / ALE, , то есть конечных продуктов гликирования или липоксидации. ⁴³ Подобные оговорки применимы к производным имидазола, образованным из GO и MGO; дикарбонилы могут быть получены в результате окисления продуктов или липидов Амадори или могут быть образованы непосредственно в результате разложения триозофосфатов или ферментативного разложения серина или треонина.Для этих соединений их происхождение может быть не так важно, как их последствия, поскольку AGE и ALE, а также другие продукты окисления и нитрования белков имеют тенденцию накапливаться вместе в тканях, часто с пагубными эффектами в ответ на окислительный стресс, болезни и старение. ^{44 , 45}

Гликация и AGE при старении и болезнях

Наиболее частым признаком старения на молекулярном уровне является накопление измененных белков, как внутриклеточных, так и внеклеточных. ⁴⁶ Однако, как отмечалось выше, гликирование относительно постоянно с возрастом у здорового населения. При диабете он повышается до нового устойчивого уровня, примерно пропорционального увеличению концентрации глюкозы в крови. ⁴⁷ Напротив, AGE имеют тенденцию накапливаться в белке с возрастом; это верно для AGE, образованных как неокислительными (, например, глюкозепан), так и окислительными (, например, пентозидин) реакциями. Самые высокие концентрации ХМЛ и пентозидина обнаружены в долгоживущих белках, таких как хрусталики хрусталика и коллагены.Кристаллины, которые являются наиболее долгоживущими белками организма, имеют самый высокий уровень ХМЛ, большая часть которого получена из аскорбата. ⁴⁸ Коллаген суставов имеет более высокую концентрацию AGE по сравнению с коллагеном кожи, что соответствует более длительному периоду полужизни суставного коллагена. ⁴⁹

Накопление окрашенных, флуоресцентных и сшивающих AGE способствует понижению растворимости кристаллинов и желтому цвету, а также снижению прозрачности хрусталика с возрастом.Путем модификации коллагена и эластина AGE влияют на эластичность внеклеточного матрикса (ECM), ^{50 — 52} на связывание клеток, ^{53 — 55} и на оборот белков ECM. ⁵⁵ AGE также взаимодействуют с различными клеточными рецепторами, вызывая окислительный стресс и активируя воспалительные каскады. Например, рецептор для AGE (RAGE), белок 35 кДа ⁵⁶ и мультилигандный член суперсемейства иммуноглобулинов молекул клеточной поверхности, ^{56 , 57} , взаимодействует с разнообразным классом лигандов, включая AGE, S100 / калгранулины, амфотерин и амилоид-β пептид. ⁵⁸ Этот рецептор экспрессируется на поверхности различных клеток, включая эндотелиальные клетки, клетки почки ⁵⁹ , ⁶⁰ и Caco-2 (аденокарцинома толстой кишки человека). ⁶¹ Лигирование AGE с помощью RAGE индуцирует образование активных форм кислорода (ROS) с помощью NAD (P) H оксидазы. Свободные радикалы, в свою очередь, активируют путь Ras-MAP-киназы, который в конечном итоге приводит к активации и транслокации NF-κB. ⁶² Индукция NF-κB приводит к транскрипционной активации многих генов, включая множество генов, играющих роль в воспалении, таких как факторы некроза опухоли (например, факторы некроза опухоли).г. TNF-α) и интерлейкины 1, 6 и 8. Этот воспалительный каскад в конечном итоге способствует увеличению окислительного стресса, который участвует в патогенезе ряда хронических заболеваний. Хотя эта последовательность RAGE-опосредованных реакций была разработана в многочисленных исследованиях, все еще остаются вопросы относительно идентичности фактических AGE, которые инициируют воспалительный ответ, а также доказательства того, что подробная интерпретация некоторых исследований скомпрометирована контаминацией AGE эндотоксинами. белковые препараты. ^{63 , 64}

Накопление AGE вовлечено в развитие сосудистых, почечных, ретинальных и нервных осложнений диабета. ^{65 — 67} В частности, результаты исследования по борьбе с диабетом и осложнениями (DCCT) / эпидемиологии вмешательств и осложнений диабета (EDIC), 10-летнего проспективного исследования гликирования белков и диабетических осложнений, показали что гликированный и модифицированный ХМЛ кожный коллаген предсказывает прогрессирование ретинопатии (p <0.0001) и нефропатия (p = 0,0001) после поправки на средний HbA _1c . ⁶⁵ Поскольку диабет характеризуется дислипидемией и гиперлипидемией, а также гипергликемией, реакции липоксидации или взаимодействие между гликоксидированием и липокислением также могут способствовать накоплению AGE / ALE, таких как CML и CEL, в тканевых белках, как при сахарном диабете и атеросклерозе. ⁴³ Хроническое накопление этих соединений в тканевых белках может обеспечить основу для гликемической памяти, наблюдаемой в исследовании DCCT / EDIC, т.е.е. Ранние периоды плохого метаболического контроля увеличивали долгосрочный риск развития диабетических осложнений, несмотря на введение улучшенного контроля в более позднем возрасте. Помимо своих физических и биологических эффектов, AGE могут также влиять на химию тканей. Например, аддукты MGO к белку могут катализировать производство активных форм кислорода, ⁶⁸ , а накопление аддуктов MGO в тканевых белках участвует в развитии окислительного стресса и повреждений. ^{69 — 71}

Помимо диабета, существуют другие заболевания, характеризующиеся накоплением AGE и окислительным стрессом в тканях.Уремия ускоряет накопление AGE, отчасти из-за нарушения выведения IGP и AGE-пептидов из кровообращения — состояние, описываемое как карбонильный стресс . ⁷² Накопление AGE также увеличивается в очагах воспаления, например, Сосудистая стенка при атеросклерозе и бляшка при нейродегенеративных заболеваниях. ^{44 , 45} Есть также свидетельства того, что диетические AGE могут способствовать накоплению AGE в тканях.Диеты, богатые AGE, влияют на тонус сосудов и функцию почек, усугубляя развитие патологий при диабете и уремии. ⁷³

Поглощение, метаболическая судьба и биоактивность диетических продуктов Amadori и AGE

И продукты Amadori, и AGE были исследованы и проанализированы ⁷⁴ на предмет их абсорбции, скорости метаболизма и биологической активности. Компоненты могут (1) высвобождаться из белка пищеварительными ферментами или кишечными бактериями и абсорбироваться; (2) метаболизируется бактериями в кишечнике; или (3) выводится с калом.Абсорбированные компоненты могут выводиться с мочой или накапливаться в тканях без метаболизма. Альтернативно продукты их метаболизма могут накапливаться в плазме или тканях или выводиться из организма. Похоже, что человеческое тело обрабатывает эти соединения совершенно по-разному, несомненно, из-за разнообразия задействованных химических структур.

Несколько исследований показывают, что пищевые продукты Амадори в значительной степени метаболизируются микрофлорой толстой кишки, ^{75 — 77} , но большинство исследований биодоступности и метаболической судьбы пищевых AGE связано с ХМЛ и пирралином.Исследование на крысах показало, что большое количество ХМЛ, связанного с пищевым белком, выделялось с мочой и фекалиями; только низкие уровни были извлечены из органов. Около половины потребленных ХМЛ не было учтено как ⁷⁸ и могло быть разложено микрофлорой толстой кишки или метаболизировалось после абсорбции. У человека почти весь (~ 80%) пищевой пирралин абсорбируется, а затем быстро выводится через почки в течение 48 часов без метаболизма. ⁷⁹ В отличие от ХМЛ и пирралина, биодоступность пентозидина зависит от того, присутствует ли он в рационе в свободной или связанной с белком форме.Скорость всасывания и выведения намного выше для свободной формы. ^{80 , 81}

К сожалению, нет хорошо спланированных исследований, касающихся биологической активности пищевых AGE. В одной группе статей, полученных в результате исследований острого и хронического кормления с четко определенными диетами ^{82 — 84} как на животных, так и на людях, сообщается о (1) положительной корреляции между AGE в диете и плазме и резистентностью к инсулину; (2) положительная корреляция между уровнями AGE в сыворотке после приема пищи и маркерами воспаления; и (3) повышенное удержание пищевых AGE в плазме и тканях почечных пациентов по сравнению со здоровым контролем.Однако второстепенные компоненты в этих диетах и ​​антиоксидантная способность диет с высоким и низким AGE не были определены, но можно ожидать, что они будут различаться. Кроме того, существует неопределенность в отношении иммунологических методов, используемых в этих исследованиях, и сомнения относительно линейности ответа теста в широком диапазоне концентраций AGE, методологии измерения AGE в продуктах, богатых липидами (например, сливочном масле), и влиянии других компоненты матрицы по ответу.

Некоторые совсем недавние исследования возможных эффектов пищевых AGE или продуктов реакции Майяра (MRP) начинают проливать свет на биоактивность.Исследование на мышах, включающее корм для мышей с низким ВОЗРАСТОМ, с добавлением и без добавления модифицированного MGO BSA, привело к повышенным уровням AGE в сыворотке и повышению уровня изопростанов в плазме. ⁸⁵ Напротив, рандомизированное перекрестное исследование диетического вмешательства с участием здоровых субъектов, получавших диету с низким или высоким MRP в течение двух недель, продемонстрировало отсутствие влияния на различные плазменные маркеры окислительного повреждения или антиоксидантной защиты. ⁸⁶ Фактически, диеты с высоким MRP обладали более высокой антиоксидантной активностью in vitro и , а образцы эритроцитов после вмешательства, подвергнутые окислению, показали более высокую антиоксидантную способность после диеты с высоким MRP.Таким образом, необходимы более хорошо спланированные исследования, чтобы полностью понять эффекты in vivo пищевых AGE и MRP, особенно их роль в стимулировании гликирования и ускоренного гликирования эндогенных белков.

ТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ FL И ВОЗРАСТА ТКАННЫХ БЕЛКОВ

В пищевых продуктах основной характеристикой реакции Майяра является формирование цвета из-за конечных продуктов реакции. Таким образом, самым простым способом оценки степени реакции является измерение поглощения, пропускания или отражения света в видимой области. In vivo цветообразование в большинстве случаев не является основным симптомом. Вместо этого можно измерить флуоресценцию, которая развивается раньше цвета и является более чувствительной. Различные сшивающие AGE, такие как пентозидин, кросслайны и весперлизины, являются флуоресцентными (). ²

Хотя абсорбционная и флуоресцентная спектрофотометрия могут использоваться для отслеживания хода реакции Майяра, они не дают никаких указаний о природе конкретных продуктов реакции. Напротив, жидкостная или газовая хроматография (ЖХ, ГХ) в сочетании с относительно неспецифическими детекторами (например,(например, флуоресценция в случае ЖХ и ионизация пламенем в случае ГХ) позволяет точно определять количество FL и AGE при использовании аутентичных стандартов. Если ЖХ или ГХ сочетаются с масс-спектрометрией (МС) и используются стандарты стабильных изотопов, то эти соединения могут быть определены количественно с высокой степенью специфичности и чувствительности. ^{47 , 87 — 89}

Однако перед применением этих хроматографических методов белки ткани должны быть гидролизованы для высвобождения свободных FL и AGE.Гидролиз легче всего осуществить путем нагревания в сильной кислоте (например, 6M HCl при 110 ° C в течение 24 часов). Недостатком полного гидролиза белка является то, что FL и некоторые AGE, такие как гидроимидазолоны, нестабильны в этих условиях. Модифицированный подход заключается в восстановлении связанных с белком продуктов Амадори до их соответствующих спиртов (например, с помощью боргидрида натрия) и для количественного определения гекситоллизина после кислотного гидролиза. В качестве альтернативы были разработаны процедуры гидролиза, основанные на ферментативном расщеплении белков, что позволяет проводить всесторонние измерения как кислотоустойчивых, так и лабильных молекул. ^{47 , 90}

ПРОТЕОМНЫЕ МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ ПРОДУКТОВ AMADORI И ВОЗРАСТА НА ТКАНЕВЫЕ БЕЛКИ

Хотя общие уровни продукта Amadori и возраст в тканях могут быть измерены с помощью ЖХ или ГХ-МС, любая информация, касающаяся идентичность модифицированных белков и их сайтов модификации теряется. Знание того, какие белки модифицируются, и степень их модификации дадут новое представление о широком влиянии модификации белков, которая может быть более важной, чем глюкоза крови натощак или только HbA _1c , как средство прогнозирования риска инфаркта миокарда. ³² Анализ конкретных белков может привести к новым и более чувствительным маркерам риска или прогрессирования диабетических осложнений.

В следующих разделах мы описываем, как подходы протеомики на основе МС могут быть использованы в анализе степени гликирования белка и образования AGE, используя методологию, специфичную для модифицированного Амадори белка в качестве примера.

Обогащение гликированных белков с помощью боронатной аффинной хроматографии

Как обсуждалось выше, степень гликирования белков варьируется от следовых количеств в короткоживущих белках до 20-30% в долгоживущих белках. ^{33 — 35} Однако по самой своей природе методы протеомики на основе МС имеют тенденцию обеспечивать измерения наиболее распространенных белков в образце из-за конечного динамического диапазона оборудования и, в меньшей степени, подавление ионизации белков или пептидов с низким содержанием, присутствующих в сложных смесях, таких как плазма, особенно при использовании матричной лазерной десорбционной ионизации (MALDI) или ионизации электрораспылением (ESI). ^{91 — 95} Таким образом, чтобы получить как можно более полный охват гликированного протеома, модифицированные Амадори белки должны быть отделены от немодифицированных пептидов перед протеомным анализом на основе МС, чтобы снизить общий сложность образца.

Одно- и двумерные гель-электрофорезы (1- и 2-DGE) широко используются в протеомных исследованиях для разделения белков на полосы или пятна. В сочетании с вестерн-блоттингом со специфическими антителами, индуцированными против продукта Amadori на лизине или его восстановленном эквиваленте (гекситоллизин), такое разделение белков на основе размера или заряда может дать общее представление о количестве гликозилированных белков в образце. Хотя 1- и 2-DGE не широко используются для отделения гликированных белков от немодифицированных, они использовались для изучения уровня гликирования белков в спинномозговой жидкости у людей с болезнью Альцгеймера, ⁹⁶ , а также в анализе гликированных белков плазмы в пациенты с диабетом 2 типа. ⁹⁷ Полосы или пятна, соответствующие гликированным белкам, могут быть удалены из гелей и впоследствии проанализированы с использованием подхода протеомики на основе МС. Несмотря на то, что подходы на основе геля для разделения белков широко используются, они имеют низкую производительность и умеренную чувствительность и не будут обсуждаться далее.

Боронатная аффинная хроматография является альтернативой гелевым методам отделения гликированных от немодифицированных белков и может быть легко автоматизирована с использованием коммерческих или собственных колонок для ВЭЖХ с набивкой.Таким образом, боронатная аффинная хроматография представляет собой высокопроизводительный метод селективного обогащения гликозилированных белков из сложных белковых смесей перед протеомными анализами на основе МС. Этот метод основан на высокоспецифическом и обратимом взаимодействии между тетраэдрическим анионом, образованным из бороновой кислоты при щелочном pH, и 1,2--цис- -диолами, обычно встречающимися в сахарах. Негликозилированные частицы могут быть отмыты от связанной с полимером боронатной смолы, в то время как оставшиеся гликированные белки могут быть элюированы снижением pH буфера или добавлением источника конкурирующих гидроксильных групп, такого как сорбитовый буфер ().

Показано равновесие между бороновой кислотой и CIS -диол-содержащими соединениями

Аффинное присоединение, элюирование и регенерация бороновой кислоты. Воспроизведено из Journal of Proteome Research, 7, Zhang Q et al. , Обогащение и анализ неферментативно гликированных пептидов: боронатная аффинная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией диссоциации с переносом электрона, стр. 2323–2330, 2007, с разрешения Американского химического общества.

Полезность боронатной аффинной хроматографии для обогащения гликозилированных белков заключается в ее специфичности.Недавно мы оценили аффинность связывания боронатной смолы с неферментативно гликированной РНКазой и ферментативно гликозилированными белками α-1-антихимотрипсином и α-2-hs-гликопротеином, которые содержат 6 N-связанных, 2 N-связанных и 3 O-связанных гликанов. соответственно. ⁹⁸ Результаты показали, что гликозилированная РНКаза связывается с боронатной смолой, а гликозилированные белки — нет (). Неспособность гликозилированных белков связываться с боронатной смолой объяснялась электростатическим отталкиванием между боронат-анионом и отрицательно заряженными остатками сиаловой кислоты в этих белках, а также возможными стерическими эффектами из-за сложной структуры более крупных гликанов.Кроме того, копланарные цис -диолы , присутствующие в продукте Amadori, вероятно, связываются с боронатной смолой с более высоким сродством по сравнению с экваториальными или некопланарными цис -диолами в гликанах. ⁹⁸

Боронатная аффинная хроматография с различными стандартными белками

Следы помечены соответствующим названием образца. GRNase 3, RNase ликелировали in vitro в течение 3 дней; GRNase 14, RNase гликировали in vitro в течение 14 дней.Пики примерно через 2 минуты представляют собой негликированные белки, а гликозилированные белки элюируются примерно через 15 минут. Воспроизведено из Journal of Proteome Research, 7, Zhang Q et al. , Обогащение и анализ неферментативно гликированных пептидов: боронатная аффинная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией диссоциации с переносом электрона, стр. 2323–2330, 2007, с разрешения Американского химического общества.

На практике использование боронатной аффинной хроматографии сопряжено с проблемами — стерические факторы могут ограничивать связывание некоторых гликозилированных белков и, в зависимости от плотности лиганда, катионные и богатые серином / треонином белки могут неспецифически связываться с боронатом. смола.Тем не менее, боронатная аффинная хроматография была успешно использована в недавнем исследовании для обогащения гликированных белков из сыворотки крови человека. В этом исследовании мы оценили двухэтапную схему обогащения для селективного выделения сначала гликозилированных белков, а затем гликозилированных триптических пептидов из сыворотки крови человека, гликозилированной in vitro . ⁹⁸ Эта работа показала, что двухэтапная процедура обогащения привела к немного лучшей специфичности по сравнению с обогащением только гликированными триптическими пептидами. Однако двухэтапная процедура обогащения также приводит к большей потере образца по сравнению с обогащением только на уровне пептидов.Таким образом, когда исходное количество образца ограничено, рекомендуется обогащение гликированными триптическими пептидами в рамках двухэтапной процедуры.

В дополнение к боронатной аффинной хроматографии недавно был разработан боронатный аффинный чип как высокопроизводительный метод анализа гликированных белков в сочетании с MALDI-time of flight (TOF) MS. Гонтарев и др. использовал гидрогель агарозы для создания аффинного слоя высокой емкости на модифицированной алюминиевой поверхности, на которой иммобилизована 3-аминофенилбороновая кислота в качестве лиганда для аффинной сорбции гликированных белков. ⁹⁹ Иммобилизованные белки затем анализировали непосредственно с использованием MALDI-TOF MS. Емкость пятна аффинного чипа была довольно высокой из-за трехмерной структуры геля, которая позволила исследователям получать спектры с большим количеством пиков и анализировать второстепенные компоненты сложных биологических жидкостей. ⁹⁹

Следует отметить, что метод сродства к боронату не специфичен только для продукта Amadori, но может также связывать другие формы модифицированных белков, например.г. те, которые содержат дезоксиглюкозоны и фосфорилированные сахара. Есть некоторые доказательства, основанные на хроматографических методах, что гликирование гемоглобина увеличивается в эритроцитах в ответ на окислительный стресс. ^{100 — 103} Тот факт, что гликирование не является окислительным процессом, предполагает, что другие углеводы, образующиеся в эритроцитах с окислительным стрессом, могут реагировать с белком. Выделение этих продуктов с помощью боронатной аффинной хроматографии и анализ методами МС могут дать уникальное представление о химических последствиях окислительного стресса.

Подходы МС без секвенирования к измерению гликирования белков

Характерный сдвиг массы, вызванный продуктом Amadori (Δm 162 Да), можно использовать для идентификации гликозилированных белков. ^{104 — 106} Lapolla et al. использовал MALDI-TOF MS для количественной оценки степени гликирования человеческого сывороточного альбумина (HSA) у лиц с диабетом 1 типа. Они обнаружили Δm от 439 до 2403 Да в HSA от 20 пациентов с плохо контролируемым диабетом, что примерно соответствует добавлению от 3 до 15 продуктов Amadori. ¹⁰⁴ Напротив, HSA от 10 человек с хорошо контролируемым диабетом содержал только 2-3 продукта Amadori, тогда как HSA от здоровых контрольных субъектов практически не содержал модификации Amadori. ¹⁰⁴ Те же авторы сообщили об аналогичной тенденции гликирования IgG у здоровых и диабетических субъектов, что вызвало сомнения в нормальной иммунологической функции IgG у пациентов. ¹⁰⁶

Основным преимуществом этого подхода, особенно при использовании MALDI-TOF MS, является высокая пропускная способность и минимальная предварительная обработка образцов.Однако использование этого метода для анализа гликозилированных белков имеет ряд недостатков. Многие посттрансляционные модификации, как ферментативные, так и неферментативные, могут присутствовать в одном и том же белке; таким образом, общий сдвиг массы модифицированного белка будет отражать сумму всех модификаций. Кроме того, массовый сдвиг, характерный для продукта Амадори, Δm 162 Да, также может быть результатом неполного или непостоянного включения остатков галактозы или маннозы в олигосахариды гликозилированных белков.Эти недостатки серьезно затрудняют анализ данных о гликированном белке. Кроме того, этот подход не дает никакой информации о фактическом сайте модификации в аминокислотной последовательности белка.

Подходы протеомики снизу вверх для измерения гликирования белков

Современную протеомику на основе МС можно разделить на два подхода: сверху вниз и снизу вверх. Протеомика «сверху вниз» включает ионизацию интактных белков с использованием ESI или MALDI с последующей их газофазной фрагментацией с помощью тандемной МС (МС / МС) с получением масс как предшественника белка, так и его фрагментов. ¹⁰⁷ Приборы с высоким разрешением по массе, такие как TOF или МС с ионно-циклотронным резонансом с преобразованием Фурье (FTICR), необходимы для этого подхода, чтобы разделить несколько изоформ одного и того же белка и, для белков, ионизированных с помощью ESI, для разделения отдельных изотопов высоко заряженные белки. На сегодняшний день не сообщалось об исследованиях, включающих нисходящий протеомный анализ гликированных белков. Таким образом, наше обсуждение протеомики, основанной на МС, будет сосредоточено на восходящих подходах.

В отличие от нисходящей протеомики, восходящая протеомика включает ферментативное или химическое расщепление сложных белковых смесей; полученные смеси пептидов затем анализируют с помощью МС. ¹⁰⁷ Чтобы минимизировать влияние динамического диапазона образца, подавления ионизации и недостаточной выборки во время зависимых от данных анализов МС / МС, смеси пептидов обычно разделяют с помощью ЖХ перед введением в масс-спектрометр. Несколько подходов и технологий были разработаны или применены для идентификации гликозилированных пептидов и соответствующих им белков с использованием восходящей протеомики. Один метод, массовый фингерпринт пептидов, основан только на анализе гликозилированных пептидов с помощью масс-спектрометрии; остальные методы используют анализ гликозилированных пептидов MS / MS.Все эти методы требуют ферментативного расщепления гликозилированных белков на составляющие их пептиды.

Массовый фингерпринт пептидов

Методы массового фингерпринтинга пептидов основаны на массовом сдвиге (Δm 162 Да), сообщаемом пептидам продуктом Amadori. В этом подходе использовались LC-MS ^{108 , 109} и MALDI-TOF MS ^{110 , 111} , и гликированные пептиды идентифицируются на основе сравнения наблюдаемых масс пептидов с массами. пептидов, полученных при расщеплении in silico .Используя масс-дактилоскопию пептидов на основе ЖХ-МС, Brock et al. определил, что основными сайтами гликирования в РНКазе, гликированной in vitro , были K41, K7, K1 и K37. ¹⁰⁸ В то время как фингерпринт пептидной массы использовался для идентификации определенных специфических сайтов гликирования при инкубации модельных белков с глюкозой, идентификация сайтов гликирования во многих случаях была неоднозначной — основывалась только на увеличении массы, вызванном продуктом Амадори. Эта неоднозначность представляет проблему, когда ферментативное расщепление приводит к пептидам, содержащим более одного остатка лизина, каждый из которых способен нести модификацию Амадори.Следовательно, этот подход трудно распространить на более сложные анализы гликирования на протеомном уровне. Однако, поскольку традиционно было трудно получить последовательность гликозилированных пептидов с использованием подходов МС / МС, для идентификации и количественного определения гликозилированных пептидов все еще используются методы масс-спектрометрии пептидов.

Диссоциация, индуцированная столкновением, MS / MS

Недавно для секвенирования гликированных пептидов использовали диссоциацию, индуцированную столкновением (CID) -MS / MS. К сожалению, ионы с высоким содержанием, соответствующие различным потерям нейтрали (т.е.е. H ₂ O, 2 H ₂ O, 3 H ₂ O, 4 H ₂ O, 3 H ₂ O + HCHO и C ₆ H ₁₀ O ₅ ) доминировал в спектрах МС / МС, и наблюдалась очень ограниченная и слабая фрагментация пептидного остова (). ^{112 — 114} Во время CID-MS / MS, внутримолекулярное перераспределение колебательной энергии происходит до разрыва связи. Таким образом, самые слабые связи в модификациях боковой цепи пептида имеют тенденцию предпочтительно диссоциировать, что приводит к нейтральным потерям для модификаций с лабильными функциональными группами (например,г. гидроксильные группы на продукте Амадори). В то время как определенные нейтральные потери (например, различные нейтральные потери воды в сочетании с образованием иона фурилия из-за нейтральной потери 3 h3O + HCHO) могут использоваться для указания на присутствие гликозилированного пептида, информация, приводящая к уверенной идентификации последовательность гликированного пептида будет недоступна. ^{112 — 114}

Сравнение спектров, полученных в режимах CID- и ETD-MS / MS

MS / MS-спектры, полученные в режимах фрагментации CID (a) и ETD (b) соответственно м / z 499.6, [M + 3H] ³⁺ пептида LVDkFLEDVKK из предшественника α-1-антитрипсина. «K» представляет собой модификацию лизина глюкозы Амадори. На вставке (а) показано увеличение для ионов между m / z 445,5 и m / z 487,4; идентифицированные ионы c и z были помечены выше и ниже последовательности в (b). Воспроизведено из Journal of Proteome Research, 7, Zhang Q et al. , Обогащение и анализ неферментативно гликированных пептидов: боронатная аффинная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией диссоциации с переносом электрона, стр.2323–2330, 2007 г., с разрешения Американского химического общества.

Чтобы преодолеть образование нейтральных потерь и получить информацию о последовательности во время CID-MS / MS гликированных пептидов, Brady et al. недавно разработал новый метод, включающий восстановление продукта Амадори боргидридом натрия перед ферментативным расщеплением и анализом пептидов. ¹¹⁵ Боргидрид восстанавливает кетон продукта Амадори, что стабилизирует связь между пептидом и остатком сахара.В результате спектральное качество MS / MS было значительно улучшено, и авторы смогли идентифицировать ряд сайтов гликирования, которые были распределены по субъединицам как легкой, так и тяжелой цепей в веществах с принудительной деградацией и антителами в составе лекарственного средства. ¹¹⁵ Недостатком этого метода является то, что в сложных образцах белков различные функциональные группы в других молекулах также могут быть уменьшены, что усложняет процесс идентификации пептидов из-за введения артефактов.

Сканирование ионов-предшественников CID-MS / MS

FL генерирует ион иммония при m / z 192.1, что характерно для модификации Amadori. Этот ион недавно был использован для картирования сайтов гликирования на бычьем сывороточном альбумине (BSA) с использованием квадрупольной TOF (Q-TOF) MS и метода сканирования ионов-предшественников; полное покрытие последовательности было получено для модифицированных Амадори пептидов БСА на основе одно- и двухзарядных γ-ионов фуриллия, а также двухзарядных γ-ионов пирилия. ¹¹³ Однако из-за ограничения по малой массе всех коммерческих инструментов с цилиндрическими или линейными ионными ловушками этот метод сканирования ионов-предшественников ограничен для приложений в восходящей протеомике.

В качестве альтернативы, потеря нейтрали в 162 Да, соответствующая всей части Амадори, наблюдалась в дополнение к последовательным потерям нейтральной воды во время анализа CID-MS / MS гликированных пептидов с помощью Q-TOF MS при умеренном столкновении. энергии. ²⁴ Поскольку потеря нейтрали в 162 Да уникальна для гликированных пептидов, на основе сканирования потери нейтральности в белках был разработан метод предварительного скрининга и секвенирования, состоящий из двух сегментов. Пептиды, несущие продукт Amadori, первоначально были идентифицированы по нейтральной потере 162 Да во время первого сегмента.Во втором сегменте идентифицированные гликированные пептиды фрагментировали при более высоких энергиях столкновения, чтобы получить информацию о пептидной последовательности и сайте гликирования. Затем для идентификации сайтов гликирования в HSA использовали двухсегментный метод нейтральных потерь, в дополнение к сдвигу времени удерживания и точной информации о массе; 31 из 59 общих остатков лизина были идентифицированы как частично гликированные in vitro. ²⁴ Благодаря своей селективности этот метод способен обнаруживать и секвенировать гликозилированные пептиды с низким содержанием, которые могут совместно элюироваться с негликозилированными частицами.

Будучи многообещающими, оба вышеупомянутых метода сканирования ионов-прекурсоров основывались на приборах Q-TOF, использующих функции, недоступные для приборов с ионной ловушкой; последние чаще используются для восходящих протеомных экспериментов на основе ЖХ-МС. Дополнительным ограничением является то, что оба были оценены только для одного модельного белка; неясно, как эти подходы будут работать со сложной смесью пептидов, полученной в результате ферментативного переваривания биожидкостей или клеточных экстрактов.

MS

³ с запуском нейтрали и многоступенчатая активация CID-MS / MS

Были разработаны альтернативные усовершенствованные методы CID-MS / MS для более полного использования возможностей ионных ловушек MS ⁿ для секвенирования пептидов содержащие лабильные модификации.Например, для анализа фосфопептидов были разработаны методы MS ³ (NLMS ³ ), зависящие от данных, и методы многоступенчатой ​​активации (MSA) из-за интенсивной потери нейтральной фосфорной кислоты, производимой этим. модификация во время CID-MS / MS. ^{116 , 117} Зависящая от данных NLMS ³ функционирует, сначала выделяя ион-продукт, образовавшийся во время сканирования MS ² и соответствующий указанной потере нейтрали, который затем активируется и диссоциирует в следующих МС ³ этап.Аналогичным образом, MSA или псевдо-MS ³ был разработан, чтобы избежать потери информативных последовательностей ионов из основной цепи пептидов, содержащих лабильные посттрансляционные модификации на стадии MS ² . В этом подходе ион-предшественник сначала фрагментируется на стадии MS ² , а ионы-продукты, соответствующие указанным нейтральным потерям, дополнительно активируются и фрагментируются на стадии MS ³ . Ионы-продукты (MS ² ) из исходного иона-предшественника и активированные ионы-продукты нейтральной потери (MS ³ ) затем одновременно сохраняются, и создается составной спектр, содержащий ионы из всех активированных предшественников. .

Мы недавно оценили различные подходы NLMS ³ и MSA во время анализа LC-MS ⁿ модифицированных Амадори пептидов, обогащенных белками сыворотки крови человека, гликозилированными in vitro . ¹¹⁸ Во время экспериментов MS ³ , вызванных нейтральной потерей, MS ³ сканирований, инициированных нейтральными потерями 3 H ₂ O или 3 H ₂ O + HCHO, дали аналогичные результаты с точки зрения идентификации гликированных пептидов ( ). Однако нейтральные потери 3 H ₂ O привели к значительно большему количеству идентификаций гликированных пептидов во время экспериментов с MSA.В целом подход MSA дал больше идентификаций гликозилированных пептидов, тогда как подход NLMS ³ привел к гораздо более высокой специфичности. Почти все пептиды, идентифицированные NLMS ³ , были модифицированы Амадори, что обеспечило дополнительный уровень уверенности в результатах. Кроме того, для поиска в базе данных наборов данных NLMS ³ требовалось примерно на 90% меньше времени по сравнению с наборами данных MSA, потому что при использовании этих подходов поиск выполняется только в сканированных изображениях MS ³ .В целом, значительное совпадение идентификаций с использованием этих двух передовых стратегий CID-MS / MS не указывает четко, какой метод следует использовать при секвенировании пептидов, модифицированных Амадори.

Сравнение спектров, полученных при стандартном и расширенном CID-MS / MS

(a) Спектр продукта-иона, полученный в результате CID-MS / MS фрагментации иона [M + 3H] ³⁺ пептида RTHLPEVFLSK * VLEPTLK, где * обозначает сайт модификации Амадори. На увеличенной врезке показаны различные потери нейтрали.Спектры продуктовых ионов, полученные из иона [M + 3H] ³⁺ пептида RTHLPEVFLSK * VLEPTLK в соответствии с b) NLMS ³ , вызванным нейтральной потерей 3 H ₂ O или c) MSA, запущенной нейтральной потерей 3 H ₂ O, где * представляет собой сайт модификации аддукта Амадори.

Диссоциация с переносом электронов MS / MS

Реализация диссоциации с захватом электронов (ECD) на масс-спектрометрах FTICR представляет собой значительный прогресс в тандемной масс-спектрометрии. ¹¹⁹ Будучи неэргодичным по своей природе (, то есть диссоциация связи происходит до перераспределения энергии), ECD обеспечивает более обширную фрагментацию последовательности и позволяет лабильным модификациям оставаться нетронутыми. Он успешно применяется для секвенирования пептидов, содержащих лабильные посттрансляционные модификации, включая большие пептиды и даже интактные белки. Недавно Хант и его коллеги разработали метод диссоциации с переносом электрона (ETD), используя модифицированный масс-спектрометр с линейной ионной ловушкой. ¹²⁰ ETD похож на ECD, но в качестве переносчика электронов использует ароматические анионы. Он произвел обильное количество c- и z-ионов пептидного остова во время MS / MS анализов фосфопептидов, что привело к почти полному охвату последовательностей в спектрах фрагментации ETD. Как и ECD, ETD хорошо подходит для характеристики пептидов, содержащих лабильные посттрансляционные модификации.

Мы сообщили о первом применении ETD-MS / MS для анализа гликированных синтетических пептидов. ¹¹⁴ В отличие от того, что обычно наблюдается во время анализа гликозилированных частиц при CID-MS / MS, в спектрах ETD-MS / MS не наблюдались ионы, соответствующие нейтральным потерям воды или образованию ионов фурилия.Вместо этого наблюдалась обильная и почти полная серия ионов c и z (). Это исследование убедительно показывает, что ETD-MS / MS особенно полезен для секвенирования гликозилированных пептидов по сравнению с традиционным методом CID-MS / MS; лабильное соединение Амадори остается интактным во время ETD-MS / MS, облегчая идентификацию пептидной последовательности и сайта модификации Амадори.

Мы дополнительно оценили эффективность ETD- и CID-MS / MS во время восходящего протеомного анализа сложного образца.Модифицированные пептиды, полученные в результате триптического переваривания гликированной сыворотки человека in vitro , сначала обогащали на уровне белка, а затем на уровне пептидов с помощью боронатной аффинной хроматографии с последующим анализом LC-MS / MS. ETD- и CID-MS / MS сканирование одних и тех же ионов-предшественников выполняли поочередно, чтобы обеспечить справедливое сравнение между двумя методами фрагментации. ⁹⁸ ETD-MS / MS дала значительно больше идентификаций гликированных пептидов (156 идентифицированных спектров) по сравнению с CID-MS / MS (15 идентифицированных спектров) на основе автоматической спектральной идентификации MS / MS.Дополнительным преимуществом анализа гликозилированных пептидов методом ETD-MS / MS является более высокая достоверность идентификации; баллы автоматической спектральной идентификации были намного выше для гликированных пептидов, идентифицированных с помощью ETD-MS / MS, чем с CID-MS / MS. Это привело к более низкому уровню ложного обнаружения гликированного пептида (FDR) для видов, идентифицированных с помощью ETD-MS / MS (средний FDR 3,1%), чем с помощью CID-MS / MS (средний FDR 6,7%). ⁹⁸ Разница в FDR для двух методов обусловлена ​​значительно лучшим покрытием последовательностей гликозилированных пептидов, полученных с помощью ETD-MS / MS, по сравнению с CID-MS / MS.Эти результаты дополнительно демонстрируют полезность ETD-MS / MS для анализа гликозилированных пептидов в восходящих протеомных исследованиях.

Мы недавно сообщили о первом высокопроизводительном восходящем протеомном исследовании гликированных белков в плазме крови человека и мембранах эритроцитов людей с нормальной толерантностью к глюкозе (NGT), нарушенной толерантностью к глюкозе (IGT) и сахарным диабетом 2 типа (T2DM). ¹²¹ Боронатную аффинную хроматографию использовали для обогащения гликозилированных белков и гликозилированных триптических пептидов как из плазмы крови человека, так и из мембран эритроцитов с последующим анализом LC-ETD-MS / MS в двух экземплярах.Этот подход привел к идентификации 260 и 75 уникальных гликированных пептидов (гликированный пептид FDR <1%) из плазмы и мембран эритроцитов человека соответственно, что соответствует 76 и 31 уникальному гликированному белку - наибольшему количеству уникальных гликированных белков, идентифицированных в плазме крови. белки. Хотя большинство гликированных белков можно было идентифицировать в образцах от людей с NGT, немного большее количество гликированных белков и больше сайтов гликирования было идентифицировано в образцах от людей с IGT и T2DM.

Хотя ETD-MS / MS является наиболее подходящим методом для секвенирования гликозилированных пептидов во время восходящих протеомных экспериментов, он имеет свои ограничения. Например, он менее эффективен для двухзарядных ионов и для ионов с m / z больше 850. ^{122 , 123} Кроме того, он еще не широко доступен в коммерческих масс-спектрометрах; в отсутствие ETD-MS / MS методы NLMS ³ и MSA, обсужденные выше, были бы жизнеспособными альтернативами во время высокопроизводительных восходящих протеомных исследований гликированных белков.

БУДУЩИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЗНАЧЕНИЯ РЕАКЦИИ МЕЙЯРДА ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЗАБОЛЕВАНИИ

Как обсуждалось выше, накопление AGE влияет на развитие сосудистых, почечных, ретинальных и нервных осложнений диабета ^{65 — 67} , а также при развитии воспалений при атеросклерозе и нейродегенеративных заболеваниях. ^{44 , 45} Однако истинное влияние AGE на хроническое заболевание еще не может быть полностью понято, поскольку традиционные методы их измерения приводят к потере любой информации о том, какие белки модифицируются, где эти модификации происходят, и в какой степени.Например, наблюдение увеличения ХМЛ в белках плазмы может быть бесполезным, если большая часть изменений происходит в альбумине. Однако, если обнаруживается, что несколько важных сигнальных белков модифицированы на участках, жизненно важных для их функции, то их модификация может иметь большее влияние на развитие и прогрессирование заболевания. Мы предполагаем, что дальнейшее изучение реакции Майяра при хронических заболеваниях будет заключаться в передовых методах протеомики, особенно в восходящих подходах. Как показано в предыдущих разделах для белков, модифицированных Амадори, методы восходящей протеомики могут использоваться для окончательной идентификации последовательности модифицированного пептида, сайта модификации и соответствующего белка, который содержит модифицированный пептид.Возможности методов восходящей протеомики для анализа сайт-специфичности модификации белков будут обсуждаться в следующем разделе.

Сайт-специфичность гликирования и образования AGE

Гликация не является случайной реакцией — аминогруппы на белке сильно различаются по скорости и степени гликирования. Для гемоглобина с 22 остатками лизина на α / β-димер основными сайтами гликирования in vivo являются, в следующем порядке: βV ₁ , βK ₆₆ , αK _61, βK ₁₇ и αV _{. 1} .Лизины 7, 16, 120 и, возможно, 144 также гликируются во время инкубации карбоксигемоглобина с глюкозой in vitro . ¹²⁴ Таким образом, помимо четких доказательств специфичности гликирования, гликация in vitro не обязательно совпадает с гликированием in vivo. Специфичность гликирования определяется как структурой белка, так и эндогенными лигандами, и как кислотные, так и основные соседние группы влияют на специфичность гликирования белка, ¹²⁵ либо посредством воздействия на pKa аминогруппы, что усиливает ее нуклеофильности и кинетики образования основания Шиффа, или посредством катализа перегруппировки Амадори, которая является лимитирующей стадией гликирования.Анионные лиганды также являются мощными катализаторами гликирования в определенных сайтах белка; предпочтительное, в 10 раз большее гликирование βV1 по сравнению с αV ₁ в Hb, несмотря на их сходные pKa, объясняется катализом перегруппировки Амадори 2,3-бисфосфоглицератом, связанным в аллостерическом сайте рядом с βV1; фосфат и бикарбонат оказывают сходное влияние на специфичность гликирования гемоглобина in vitro . ¹²⁶ Анионные буферы фосфат, арсенат и бикарбонат также катализируют предпочтительное гликирование K ₄₁ в катионном РНК-связывающем сайте рибонуклеазы.В целом гликирование менее специфично, чем гликозилирование, которое может определяться аминокислотной последовательностью в белке, но гликирование не является случайным. Это часто происходит на специализированных сайтах по белку, например, . — аллостерический сайт гемоглобина, сайт связывания субстрата РНКазы и сайты связывания жирных кислот и лекарств на альбумине. Хотя эти модификации имеют очевидный эффект на функцию белка или фермента in vitro , существует мало доказательств того, что само гликирование является патологически значимым.

Напротив, накопление AGE сильно вовлечено в патогенез хронического заболевания. Однако гораздо меньше известно о распределении белков-мишеней и сайт-специфичности образования AGE. Метилглиоксаль (MGO), дикарбонильный промежуточный продукт и предшественник AGE, образующийся во время реакции Майяра, реагирует в первую очередь с остатками аргинина в белке, образуя производное имидазола. Arg-410 был идентифицирован как основной сайт модификации альбумина с помощью MGO in vitro и in vivo , ¹²⁷ , в то время как Arg-39 является основным сайтом модификации РНКазы с помощью MGO in vitro . ¹²⁸ Модификация Arg-410 ингибировала эстеразную активность альбумина, а Arg-39 находится в связывающем субстрате / активном сайте РНКазы, что позволяет предположить, что MGO может воздействовать на функционально важные остатки в белках. ¹²⁹ Действительно, в двух недавних исследованиях сообщалось о модификации MGO остатков аргинина в сайтах связывания интегрина Arg-Gly-Asp и Gly-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg коллагена типа IV, вызывающих отслоение обоих эндотелиальных клеток ⁵⁴ и ингибирование адгезии эндотелиальных клеток. ⁵³

Хотя очевидно, что гликирование и AGE увеличиваются при старении и болезнях, существует немного исследований по специфичности образования аддуктов AGE и поперечных связей в более широком спектре тканевых белков, но именно здесь действие, , то есть патология, имеет место. Как обсуждалось выше, большая часть того, что мы знаем о гликировании и образовании AGE, основано на исследованиях гемоглобина, альбумина и РНКазы. Недавние исследования РНКазы предполагают, что окисление аддукта Амадори является основным источником AGE CML в гликозилированных белках, i.е. , что специфичность карбоксиметилирования такая же, как и у гликирования. ¹⁰⁸ Аналогичным образом, как внутри-, так и межмолекулярное сшивание РНКазы с помощью AGE-глюкозепана происходит в основном на остатках лизина и аргинина, которые наиболее реактивны с глюкозой и MGO. ^{128 , 130} Хотя специфичность образования AGE, по-видимому, отслеживает специфичность гликирования, реакции гликоксидирования зависят от катализируемого металлами окисления гликозилированных белков. Однако мало что известно в деталях о взаимосвязи между сайтами связывания металлов, e.г. по остаткам гистидина и анионным центрам в белке, а также кинетика или специфичность образования AGE.

Применение восходящей протеомики во всестороннем исследовании гликирования белков может дать дополнительную информацию относительно сайт-специфичности модификации белков продуктами Амадори и AGE. Большой набор данных, полученный в результате такого исследования, может быть использован в попытках смоделировать горячие точки для модификации белков во время реакций Майяра. Johansen et al. недавно использовал искусственные нейронные сети для исследования гликирования остатков лизина в белке. Из 89 гликированных и 126 негликированных остатков лизина в 20 экспериментально исследованных белках авторы обучили алгоритм предсказания гликирования на основе последовательностей. ¹²⁵ Применение алгоритма в in silico оценке протеома человека выявило многие важные биологические процессы и молекулярные функции, на которые может повлиять гликирование. Всестороннее восходящее протеомическое исследование модификации белков с помощью AGE могло бы привести к аналогичному алгоритму прогнозирования, а также определить взаимосвязь между гликированием и образованием AGE.

Количественное определение гликирования белков и образования AGE в клинических образцах с использованием восходящей протеомики

Методы восходящей протеомики привлекают все большее внимание в связи с эффективностью этих подходов для анализа сложных белковых смесей, присутствующих в клинических образцах. Однако применение этих методов для анализа AGE-модифицированного белка в клинических образцах будет нетривиальным.

Подобно гликированию белков, AGE будут присутствовать в небольшом количестве на белках in vivo .Следовательно, потребуется некоторая форма обогащения для увеличения концентрации модифицированных белков перед анализом методами ЖХ-МС / МС или ЖХ-МС. Из-за их химического разнообразия маловероятно, что один метод приведет к обогащению всех AGE. Однако работа Влассара и его коллег показала, что лизоцим и лактоферрин связывают белки, несущие AGE. ¹³¹ В более поздних работах они продемонстрировали, что белки, модифицированные AGE, могут быть удалены из диабетической уремической сыворотки с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным лизоцимом. ¹³² Таким образом, лизоцим можно связать с твердой подложкой и поместить в колонку ВЭЖХ для высокопроизводительного глобального обогащения AGE-модифицированного белка из клинических образцов. К сожалению, BSA, модифицированный CML или пентозидином, не связывается с колонкой с лизоцимом; ¹³² свободный CML и свободный пентозидин также не связывались, что указывает на то, что эти AGE не были основными AGE, распознаваемыми лизоцимом. Более вероятным подходом к обогащению AGE-модифицированного белка будут иммуноаффинные методы с использованием либо иммобилизованных антител к специфическим AGE, либо иммобилизованных рецепторов, таких как RAGE.Здесь важными соображениями будут общее качество и специфичность антитела, а также его иммобилизация на твердой подложке для целей обогащения.

Помимо обогащения белков, модифицированных AGE, для анализа AGE-пептидов, полученных ферментативным расщеплением белков, могут потребоваться специальные методы. Для гликированных пептидов мы сообщили, что либо усовершенствованные методы CID-MS / MS (NLMS ³ или MSA) ¹¹⁸ , либо ETD-MS / MS ^{98 , 114} поддаются секвенированию гликированных пептидов из-за лабильные гидроксильные группы, присутствующие в продукте Amadori.Вполне возможно, что для некоторых AGE могут потребоваться аналогичные подходы. Например, AGE, полученные из 1- или 3-дезоксиглюкозона, также могут нести лабильные гидроксильные группы, которые предпочтительно фрагментируются во время традиционных экспериментов CID-MS / MS. Ожидается, что другие AGE, такие как CML, CEL и пентозидин, будут стабильными во время CID-MS / MS. Сшивки, такие как перекрестные линии, фторсвязь и DOGDIC (), также потребуют особого внимания во время автоматической идентификации спектров МС / МС пептидов с помощью коммерческого программного обеспечения (например,г. SEQUEST, SpectrumMill, Mascot, X! Tandem).

После того, как будет разработан подходящий метод для обогащения и MS / MS анализа AGE-модифицированных белков, следующим шагом будет его применение для анализа клинических образцов. Для плазмы экстремальный динамический диапазон концентрации белка становится ограничивающим фактором для подходов восходящей протеомики. Альбумин, самый распространенный белок плазмы, составляет ~ 60% массы белка плазмы. Это число увеличивается до 96% при рассмотрении 12 наиболее распространенных белков плазмы и до ~ 99% при рассмотрении 22 наиболее распространенных белков.Следовательно, динамический диапазон измерения> 10 ⁷ необходим для обнаружения многих клинически значимых белков, присутствующих на уровнях нг / мл или ниже. Применение иммуноаффинного мультибелкового истощения (например, Agilent Mixed Affinity Removal System или технология Beckman-Coulter IgY-12) является обычным подходом для увеличения динамического диапазона восходящих методов протеомики. ¹³³ Мы использовали колонку иммунного истощения IgY-12 Beckman-Coulter для истощения 12 наиболее распространенных белков в плазме человека до обогащения гликированными белками.В результате мы смогли идентифицировать 76 уникальных гликозилированных белков, многие из которых ранее не обнаруживались в гликозилированном протеоме плазмы. Однако даже после истощения иммунитета мы смогли идентифицировать только 76 гликозилированных белков плазмы. ¹²¹

Для дальнейшего увеличения динамического диапазона протеомных экспериментов на основе МС / МС использовалось многомерное разделение. К ним относятся двумерная ЖХ, электрофорез в свободном потоке, изоэлектрическое фокусирование на основе раствора и подходы на основе геля для фракционирования на уровне интактного белка и на уровне пептидов. ^{134 — 136} Например, Washburn et al. использовал технологию многомерной идентификации белков (MudPIT) для крупномасштабного протеомного анализа Saccharomyces cerevisiae . ¹³⁷ Этот подход включает хроматографию с сильным катионообменом (SCX) в сочетании с обращенно-фазовой хроматографией и значительно улучшает динамический диапазон измерения пептидов. Аналогичным образом, Liu et al. использовал 2D-LC-MS / MS в сочетании с иммунодеплецией для идентификации 300 белков плазмы. ¹³⁸ Хотя такие подходы к фракционированию значительно повысили чувствительность протеомных исследований на основе МС / МС, они демонстрируют значительные ограничения как в количественном отношении, так и в производительности.

Хотя обычно используется для идентификации пептидов, зависимая от данных МС / МС имеет несколько неотъемлемых ограничений, в том числе невозможность выбора всех хроматографических совместно элюирующих веществ для фрагментации («недостаточный отбор») и общий низкий рабочий цикл анализа (т. Е. одно сканирование MS с последующими последовательными сканированиями MS / MS).Чтобы преодолеть эти ограничения, Смит и его коллеги разработали стратегию меток точной массы и времени (AMT), которая использует капиллярную ЖХ и МС с высокой точностью измерения массы (например, FTICR) для достижения высокопроизводительных протеомных анализов; этот метод включает в себя разделение методом ЖХ с высоким разрешением, большой динамический диапазон обнаружения и повышенную чувствительность. ¹³⁹ В подходе с меткой AMT пептиды из триптического гидролизата сложной белковой смеси сначала фракционируют с помощью SCX, а затем проводят анализ каждой фракции SCX с помощью капиллярной ЖХ-МС / МС с обращенной фазой.Расчетная масса (на основе пептидной последовательности) и наблюдаемое нормализованное время элюирования каждого идентифицированного пептида включаются в базу данных тегов AMT; последующие анализы ЖХ-МС / МС с более низкой пропускной способностью больше не требуются, и база данных тегов AMT по существу служит «справочной таблицей» для последующих анализов ЖХ-Фурье МС тех же или подобных образцов. Пептид идентифицируют с помощью анализа LC-FTICR MS, когда его измеренное нормализованное по массе время элюирования совпадает с таковым для метки AMT. Эта стратегия может быть распространена на любой масс-спектрометр высокого разрешения, такой как TOF MS и новое поколение гидридных приборов.Стратегия меток AMT обеспечивает ряд преимуществ по сравнению с традиционными подходами протеомики на основе MS / MS, в том числе (1) более высокая пропускная способность за счет отказа от рутинных измерений 2D-LC-MS / MS, (2) повышенная точность количественного определения благодаря более высокому разрешению и сигналу отношение шума к шуму измерений FTICR и (3) повышенная чувствительность и динамический диапазон для большего охвата протеома. Эта стратегия применима для высокопроизводительных количественных исследований гликирования белков и образования AGE в восходящей протеомике при условии разработки базы данных меток AMT для гликированных пептидов или пептидов, модифицированных AGE.

ВЫВОДЫ

Мы прогнозируем сдвиг в методологии, используемой для измерения гликирования белков в клинических образцах в течение следующих нескольких лет, и подход с наибольшим риском и наибольшей отдачей — протеомика на основе МС. Этот подход сопряжен с высоким риском из-за затрат времени и денег на разработку методов обогащения и анализа MS / MS; это высокая отдача из-за потенциальной идентификации новых маркеров надвигающегося или прогрессирующего заболевания. Действительно, восходящая протеомика оказалась особенно полезной для идентификации белков в последнее десятилетие благодаря успехам, достигнутым в обращенно-фазовом ЖХ-разделении триптических пептидов и в инструментах МС.Важно отметить, что восходящий подход успешно применялся в последние два года в протеомных исследованиях гликозилированных белков. ^{98 , 114 , 118 , 121} Однако относительно небольшие пептиды, образующиеся при ферментативном расщеплении, создают проблему: как соотнести информацию об уровне пептидов с уровнем белка, особенно при работе с посттрансляционными модификациями и изоформами сплайсинга альтернативных белков.

Эту проблему лучше всего решить с помощью нисходящей протеомики, подхода, который также претерпел большие успехи в последние годы. Если наблюдается достаточное количество информативных ионов фрагментов белка, этот метод потенциально может обеспечить полное описание первичной структуры белка и выявить все его модификации. С этой целью Маклафферти и его коллеги продемонстрировали высокоинформативную фрагментацию белков с молекулярной массой до 200 кДа, используя диссоциацию с предварительным свертыванием, испарение при нагревании и разделение диссоциации нековалентных и ковалентных связей. ¹⁴⁰ Кроме того, Kelleher et al. успешно использовали нисходящий подход для расшифровки сложных паттернов модификаций гистонов. ¹⁴¹ Ограничением этого метода является его относительная несовместимость с ЖХ и необходимость использования масс-спектрометров высокого разрешения, таких как FTICR или Orbitrap MS.

В качестве альтернативы, протеомика по центру вниз может быть более практичным методом анализа белков с посттрансляционными модификациями, включая гликирование, благодаря недавнему усовершенствованию методов ионной фрагментации ( e.г. ECD и ETD) и внедрение удобных в использовании гибридных масс-спектрометров (, например, LTQ-Orbitrap и LTQ-FT). ^{142 , 143} Подход «середина вниз» включает очень ограниченное переваривание или химическое расщепление белков для получения относительно больших пептидов.

Хотя и нисходящая, и средняя протеомика находятся в зачаточном состоянии по сравнению с восходящей протеомикой, они, вероятно, станут важными инструментами в будущем для точного определения и количественной оценки белков с посттрансляционными модификациями и их изоформ.Подход «снизу вверх» будет по-прежнему использоваться в анализах гликозилированного белка в течение следующих нескольких лет, но его применение может исчезнуть.

Независимо от того, какой метод протеомики используется для анализа гликозилированных и AGE-модифицированных белков, для повышения чувствительности измерения потребуется некоторая форма обогащения целевой модификации. Кроме того, для лабильных AGE могут потребоваться новые подходы к МС / МС, такие как ETD.

Реакция Майяра: ключ к развитию вкуса

Реакция Майяра — важный кулинарный процесс, ответственный за развитие нового вкуса, аромата и цвета.Это улучшает вкус еды! Узнайте о науке, лежащей в основе этой важной химической реакции, и о том, как она применяется в кулинарии.

Реакция Майяра — вы хотите, чтобы это происходило во время готовки, и вот почему. Этот желанный кулинарный процесс создает сотни новых вкусовых и ароматических соединений с применением тепла. Химическая реакция — это видимое изменение цвета поверхности продуктов на потрясающий золотисто-коричневый оттенок.

Получающееся в результате сочетание вкуса и изменения цвета часто происходит при использовании методов приготовления с сухим жаром при правильной температуре, кислотности и влажности.Вы уже видели и пробовали это раньше. Это идеальная корочка для обжаренного сочного стейка рибай. Это хрустящий янтарный слой на обжаренном на сковороде кусочке палтуса. Это слоеная золотистая корочка на запеченном яблочном пироге.

Что такое реакция Майяра?

Реакция Майяра — это форма неферментативного потемнения, которое происходит в пищевых продуктах, когда белки и / или аминокислоты химически реагируют с углеводами редуцирующих сахаров. Применение тепла во время приготовления ускоряет и продолжает этот сложный процесс, улучшая вкус, аромат и внешний вид пищи.

Эксперты по кухне, такие как Натан Мирвольд, автор книги Modernist Cuisine , говорят, что реакцию Майяра следует называть «реакцией вкуса», а не «реакцией потемнения» из-за ее существенного вклада в развитие вкуса и аромата. Это безмолвная звезда кулинарии, получившая признание за второстепенную роль. Это должно измениться!

Давайте поблагодарим Луи-Камилла Майяра, французского врача, который обнаружил эту захватывающую реакцию примерно в 1910 году.Теперь мы можем пожинать плоды его кропотливого исследования и изучения. Исследования по этой теме все еще изучаются учеными-диетологами сегодня, и новые знания об этом фундаментальном принципе еще не получены.

Давай займемся наукой

Реакция Майяра проходит в несколько сложных стадий. Чтобы реакция произошла, должны быть доступны три вещи; аминокислоты, редуцирующие сахара и вода. Это будет звучать сложно, потому что это так! Но вот некоторые базовые вещи, которые происходят в процессе:

• Восстанавливающие сахара, такие как глюкоза и фруктоза, вступают в реакцию с аминокислотой, которая находится в свободном состоянии или является частью белковой цепи.
• Образуются нестабильные промежуточные структуры, называемые соединениями Амадори, которые изначально не имеют запаха и цвета.
• Созданы новые вкусовые соединения, называемые дикарбонилами.
• Продолжают образовываться сотни различных побочных продуктов, влияющих на вкус, аромат и цвет.
• Образуются молекулы пигмента меланоидина, и поверхность продуктов питания приобретает темно-коричневый цвет.

Большинство продуктов естественным образом содержат различные количества и разные типы белков и сахара.Вот почему говядина или курица в приготовленном виде и на вкус отличаются от бананового хлеба. От этого процесса выигрывают методы сильного нагрева, такие как жарка, выпечка, жарка на сковороде, фритюр, гриль, приготовление под давлением, обжаривание, тушение и тушение. Это одна из причин, по которой я всегда обжариваю мясо перед тем, как добавить его в мультиварку, потому что влажный жар в мультиварке никогда не поднимается выше 212ºF (100ºC), чтобы произошло подрумянивание по Майяру.

Роль температуры

Процесс Майяра можно начинать при комнатной температуре.Однако повышение температуры подталкивает процесс. Обычно, когда температура поверхности продукта достигает 300 ° F (149 ° C), процесс идет полным ходом. Это означает, что для среды , используемой для метода приготовления сухим жаром, необходимо установить более высокий диапазон, 350 ° F (177 ° C) и выше.

Осторожно! Реакция поджаривания велика, пока еда не пригорит (привет пиролиз!). При температуре поверхности выше 355 ° F (180 ° C) продукты становятся черными и горькими на вкус. Это тонкий баланс, требующий внимания.Так что не проверяйте соцсети слишком долго, иначе вы пожалеете!

Какую роль играет влажность

В пище требуется небольшое количество влаги на молекулярном уровне, чтобы способствовать процессу подрумянивания, хотя слишком много влаги может ухудшить его. Главное — следить за тем, чтобы поверхность еды была сухой, чтобы предотвратить запаривание и обеспечить максимальное поджаривание. Вот несколько способов удалить поверхностную влагу:

• Высушите поверхность продуктов бумажными полотенцами перед приготовлением.
• Сушите мясо и овощи на противне в холодильнике в течение ночи.
• Солите продукты прямо перед приготовлением, чтобы предотвратить появление на поверхности избыточной влаги из-за осмоса.
• Обратное обжаривание говядины в духовке перед обжариванием на сковороде сушит поверхность продукта для более быстрого подрумянивания.

При приготовлении пищи из пищи будет выделяться влага. Сильный огонь сковороды и масла поможет быстро испарить лишнюю воду. Уменьшение влажности на поверхности жареного цыпленка приведет к тому, что кожа станет хрустящей подрумяненной, быстрее.

Почему не нужна слишком высокая кислотность

С точки зрения науки, это pH или насколько щелочная (например, молоко), кислая (сморщивающий рот лимонный сок) или щелочная (например, оливки) часть пищи является. Как правило, чем более кислая среда, pH 6 и ниже, тем меньше будет потемнения. Что может быть сделано? Добавление небольшого количества щелочного ингредиента, такого как пищевая сода, усиливает реакцию потемнения.

Это хитрый трюк, используемый в китайском жарком для быстрого подрумянивания продуктов, поскольку нарезанным кускам мяса требуется всего несколько минут вок.Присыпание или подмешивание немного пищевой соды к птице, покрытой кожей, также способствует достижению хрустящей корочки и развитию цвета. Я делаю это для своих запеченных крыльев буйвола, чтобы они были хрустящими и золотистыми. Попробуйте и почувствуйте разницу!

Майяр против карамелизации: кризис идентичности

Часто карамелизация и поджаривание Майяра используются как синонимы, хотя они очень разные! Обе они являются неферментативными реакциями потемнения, но на этом сходство заканчивается. Карамелизация происходит в средах с концентрированным сахаром с очень низким содержанием влаги.Это когда сложные сахара распадаются на простые сахара, за которыми следуют другие реакции с образованием коричневого цвета.

Мой любимый пример, домашний карамельный соус. В зависимости от типа сахара карамелизация в среднем начинается при температуре 248ºF (120ºC), что намного ниже, чем реакция Майяра. Иногда подрумянивание и карамелизация по Майяру происходят кратко, только на разных уровнях.

Почему реакция Майяра вызывает выделение слюны

Хорошо, вы читаете эту статью и, вероятно, задаетесь вопросом: «Почему я должен беспокоиться обо всей этой научной чепухе?» Все сводится к следующему: реакция Майяра делает пищу более приятной для употребления.

Когда вы разогреваете пищу, ваши чувства вовлекаются в обилие молекул аромата, окружающих воздух. Неслучайно, когда я выпекал партию сырого теста для печенья, через 10 минут мой сын волшебным образом появляется на кухне из-за всех недавно появившихся сладких и теплых запахов, которые ударили его в нос. Было исследовано, что около 70% того, что вы ощущаете на вкус, на самом деле является тем, что вы чувствуете.

Приготовленная пища запускает этот животный режим выживания в нашем мозгу и включает эти слюнные железы.Уговорить реакцию Майяра — это каскадный катализатор того, что заставляет людей так увлекаться едой. Вот почему я никогда не могу отказаться от свежеиспеченного слоеного круассана, почему некоторые люди предпочитают жареный рогалик, характерный запах свежих кофейных зерен и почему шоколатье обжаривают какао-крупку, чтобы сделать темный шоколад. Итак, расскажите о себе, теперь вы знаете научную терминологию, которая улучшает вкус еды, реакцию Майяра.

Реакция Майяра — Модернистская кухня

Одной из наиболее важных реакций, вызывающих ароматизацию, при приготовлении пищи является реакция Майяра.В разговорах о кулинарии это иногда называют «реакцией потемнения», но это описание в лучшем случае неполное. Приготовленное мясо, морепродукты и другие продукты с высоким содержанием белка, которые подвергаются реакции Майяра , становятся коричневыми, но есть и другие реакции, которые также вызывают потемнение. Реакция Майяра создает коричневые пигменты в приготовленном мясе очень специфическим образом: путем перегруппировки аминокислот и некоторых простых сахаров, которые затем образуют кольца и скопления колец, которые отражают свет таким образом, чтобы придать мясу коричневый цвет.

В реакции Майяра важен не цвет, а вкус и аромат. Действительно, это следует называть «реакцией вкуса», а не «реакцией потемнения». Вырабатываемые им молекулы обеспечивают мощные ароматы, ответственные за характерные запахи жарки, выпечки и жарки. То, что начинается как простая реакция между аминокислотами и сахарами, быстро становится очень сложным: полученные молекулы продолжают реагировать все более сложными способами, в результате чего образуются буквально сотни различных молекул.Большинство этих новых молекул производится в невероятно ничтожных количествах, но это не значит, что они неважны.

Реакция Майяра возникает при приготовлении почти всех видов пищи, хотя присутствующие простые сахара и аминокислоты производят совершенно разные ароматы. Вот почему выпечка хлеба не пахнет жареным мясом или жареной рыбой, хотя вкус всех этих продуктов зависит от реакции Майяра. Реакция Майяра или ее отсутствие отличает вкус вареных, вареных или приготовленных на пару продуктов от ароматов тех же продуктов, которые были приготовлены на гриле, жареном или иным образом приготовлены при температуре, достаточно высокой для быстрого обезвоживания поверхности — другими словами, при температуре выше точки кипения воды.Эти два фактора, сухость и температура, являются ключевыми факторами, влияющими на скорость реакции Майяра.

Приготовление при высокой температуре ускоряет реакцию Майяра, поскольку тепло увеличивает скорость химических реакций и ускоряет испарение воды. По мере высыхания пищи концентрация реагирующих веществ увеличивается, а температура повышается быстрее.

Температура должна быть высокой, чтобы вызвать реакцию Майяра, но пока пища очень влажная, ее температура не поднимается выше точки кипения воды.При атмосферном давлении только методы приготовления с использованием сильного нагрева могут высушить пищу настолько, чтобы повысить ее температуру. Останавливает реакцию не вода, а низкая точка кипения при нормальном давлении на уровне моря. В герметичной среде скороварки реакция Майяра может происходить и происходит. Это то, что мы используем при приготовлении супов, как в нашем Карамелизированном морковном супе, или пюре, таких как пюре из брокколи в нашем рецепте Brassicas. Добавление пищевой соды в скороварку повышает pH пищи (делая ее более щелочной), что также помогает.Китайские повара часто маринуют мясо или морепродукты в смесях, содержащих яичный белок или пищевую соду, непосредственно перед жаркой.

Итак, во вкусе вареной, вареной и приготовленной на пару мышечной пищи преобладает совершенно другой набор ароматов. Однако сначала сушка и подрумянивание поверхности позволит реакции протекать медленно при температурах ниже точки кипения воды. Вот почему мы поджариваем замороженный стейк перед приготовлением в низкотемпературной духовке. Обжаривание продуктов перед вакуумной герметизацией и приготовление в режиме «су-вид» может добавить глубины вкусу блюд «су-вид».Этого шага следует избегать в отношении баранины, другого мяса животных, выращиваемых травой, и некоторых других продуктов, предварительная обработка которых может вызвать нежелательные реакции, вызывающие появление неприятного запаха и разогретого аромата при последующем приготовлении пищи в режиме су-вид. Мы рекомендуем поджарить эти продукты после приготовления в режиме су-вид.

Одна из проблем, связанных с запуском реакции Майяра, — это сделать поверхность достаточно горячей и сухой, не переваривая лежащую под ней мякоть или, по крайней мере, как можно меньше пережаривая ее.С этой целью повара разработали несколько стратегий, некоторые из них простые, а некоторые довольно причудливые.

Одна из эффективных стратегий — удалить как можно больше воды с поверхности мяса перед приготовлением (промоканием или сушкой при низкой температуре). Быстрый нагрев с использованием фритюрницы, сверхгорячих сковородок и грилей и даже паяльных ламп также может быть полезен, например, когда мы жарим во фритюре куриные крылышки.

Можно подумать, что повышение температуры еще больше усилит реакцию Майяра.До определенного момента это происходит, но при температуре выше 180 ° C / 355 ° F происходит другой набор реакций: пиролиз, также известный как горение. Людям обычно нравятся немного обугленные продукты, но при чрезмерном пиролизе возникает горечь. Черные соединения, образующиеся при пиролизе, также могут быть канцерогенными, поэтому не стоит обугливать пищу для визуальной привлекательности.

Адаптировано из Модернистская кухня

Что такое реакция Майяра?

Реакция Майяра (произносится как «мой-ДВОР») — это кулинарный феномен, который возникает, когда белки в пище нагреваются до температуры 310 F или выше, в результате чего они становятся коричневыми.

Названная в честь французского химика Луи-Камиля Майяра, открывшего этот процесс в начале 20-го века, реакция Майяра похожа на процесс карамелизации, когда сахар становится коричневым при нагревании.

Но меняется не только цвет. И реакция Майяра, и карамелизация также создают новые вкусы и ароматы, что является основной причиной, по которой мы заботимся о них в кулинарном смысле.

Но приготовление пищи — не единственное, что заставляет продукты становиться коричневыми.

Ферментный браунинг

Ферментативное потемнение — это процесс, при котором некоторые продукты становятся коричневыми сами по себе (или, точнее, под воздействием кислорода). Примеры: когда бананы покрываются коричневыми пятнами на кожуре или когда виноград становится коричневым, когда становится изюмом.

И вы можете почувствовать разницу. Спелый банан не только слаще незрелого, но и имеет более глубокий и сложный вкус. А изюм имеет глубокий, богатый, дымный вкус, которого не было в винограде.

Ферменты, вызывающие это потемнение, естественным образом присутствуют в продуктах, так что это буквально тот случай, когда пища становится коричневой. Это биологический процесс.

И помните, что этот процесс запускает присутствие кислорода. Вот почему яблоки становятся коричневыми вскоре после того, как вы их разрежете.

Эти ферменты могут быть дезактивированы кислотами, поэтому добавление нарезанных яблок в лимонный сок помогает предотвратить их потемнение. Тепло также может денатурировать ферменты, поэтому кратковременное бланширование авокадо помогает предотвратить его потемнение при разрезании.

Неферментативное потемнение

Неферментативное потемнение — еще один способ потемнения продуктов. Но вместо ферментов в пище это внешняя сила, а именно тепло, заставляющее ее становиться коричневым.

Тепло вызывает химические реакции в пище, вызывая образование новых химических соединений, многие из которых имеют особый вкус и аромат. И протекает не одна реакция, а сотни, каждая из которых дает новые соединения.

И эти новые соединения сами нагреваются, тем самым вызывая новые химические реакции, новые ароматические соединения и так далее, создавая каскад вкуса и аромата.Все эти вкусы и ароматы в сочетании создают очень сложный опыт для вашего носа и вкусовых рецепторов, ни одно из которых было бы невозможно в сыром виде.

Белки против. Углеводы

Таким образом, реакция Майяра происходит, когда аминокислоты в белках нагреваются. Карамелизация происходит при нагревании углеводов (то есть сахаров). И хотя это два разных процесса, иногда они дают одни и те же ароматические соединения и одни и те же изменения цвета.

Такие продукты, как морковь, грибы и лук, содержат очень мало белка, но при приготовлении они становятся коричневыми. Это означает, что в основном они подвергаются карамелизации, а не реакции Майяра.

С другой стороны, в мясе есть только белок, а также жир и вода, но нет углеводов, поэтому оно подвергается только реакции Майяра, а не карамелизации.

Такие продукты, как пшеница, содержат довольно много белка, а также углеводов, поэтому, когда хлеб поджаривается, он подвергается карамелизации по реакции Майяра и .

Картофель с низким содержанием белка, но картофель фри становится красивым и коричневым, когда он готовится, потому что реакция Майяра усиливается с повышением температуры, а жарка во фритюре — невероятно эффективный метод переноса очень высоких температур на поверхность продукта.

Для наилучших результатов промокните мясо насухо

Еще один эффект приготовления мяса — его поверхность обезвоживается и приобретает хрустящую корочку. Это, в сочетании с эффектом потемнения реакции Майяра, дает характерную коричневую «корочку» на обжаренном стейке.Но эта хрустящая текстура сама по себе не является функцией реакции Майяра, а просто результатом того, что горячая сковорода или духовка высушила поверхность мяса за счет испарения.

Однако эти два эффекта идут рука об руку. Потому что, как мы уже говорили ранее, чем выше температура, тем больше происходит подрумянивание. Если кусок мяса влажный, при ударе о сковороду выделяется пар. А максимальная температура пара составляет 212 F, что слишком мало, чтобы вызвать реакцию Майяра.

Более того, пар будет иметь эффект охлаждения сковороды, так что сковорода, которая в противном случае могла бы быть нагрета до 400 F, подвергается порыву пара 212 F, который эффективно охлаждает ее, скажем, до 300 F.Это значительно затрудняет реакцию Майяра, по крайней мере, до тех пор, пока пар не уйдет и сковорода не сможет снова нагреться.

Все это означает, что для максимальной реакции Майяра рекомендуется тщательно промокнуть мясо перед приготовлением.

Что делать при тушении

Также обратите внимание, что реакция Майяра будет иметь место только при использовании методов приготовления с сухим жаром, таких как жарение на гриле, тушение и запекание. Тушение — прекрасный способ приготовить определенные куски мяса, но при этом мясо не подрумянится, поскольку это метод влажного тепла, который заключается в погружении мяса в жидкость, которая в идеале нагревается до 205 F.Это температура, при которой соединительная ткань начинает разрушаться, но все же достаточно низкая, чтобы мясо не сварилось, что могло бы привести к его жесткости.

Очевидно, что 205 F недостаточно горячо, чтобы вызвать реакцию Майяра. Но поскольку реакция Майяра так важна для получения богатого, сложного вкуса «приготовленного мяса», к которому мы так привыкли, обычной практикой является обжаривание куска мяса на сковороде перед его тушением, чтобы у этих сложных ароматов была возможность развивать.

Некоторые повара предпочитают обжаривать мясо после его тушения , но это предотвращает проникновение этих сложных ароматов в жидкость во время процесса тушения.

Наука о мясе: «Понюхайте активность реакции Майяра»

Наука о мясе: «Понюхайте активность реакции Майяра» | Exploratorium

©
Эксплораториум | Политика использования
| Политика конфиденциальности

.