При кривошее электрофорез: Врожденная мышечная кривошея

Врожденная мышечная кривошея

Врожденная мышечная кривошея (ВМК) – это неправильное положения головы ребенка в следствие недоразвития и/или поражения шейных мышц. Первые признаки кривошеи могут наблюдаться уже на 2-3 неделе жизни малыша —  нарастание утолщения кивательной мышцы. 

При диагностировании односторонней кривошеи можно наблюдать наклон головы в больную сторону и небольшой разворот на здоровую сторону лицом. Двухсторонняя кривошея отличается откидыванием головы ребенка назад. Лечением ВМК занимается детский ортопед. Методоми лечения недуга являются массаж, ЛФК, физиотерапия и иногда — предписание ношения воротника Шанца. Кроме консервативных методов так же может применяться хирургическое лечение — удлинение грудино-ключично-сосцевидной мышцы на пораженной заболевание стороне.

Причины

ВМК может проявляться в связи с укорочиванием кивательной мышцы с пораженной стороны. Это может быть связано с ее недоразвитием, травмой при родах и рядом других причин. У детей с ВМК могут проявляться изменения форм черепа, ключиц и позвоночника. Таким образом причинами заболевания могут быть:

• недоразвитие кивательной мышцы;
• мышечная травма при родах;
• воспалительные процессы в мышцах;
• плохой мышечный кровоток.

Лечение

Определение способа лечения зависит от возраста ребенка, состояния кивательной мышцы и степени развития заболевания. Начало лечения ВМК на раннем этапе способно в полной мере устранить недуг, не прибегая к хрургическому вмешательству. В случае запущенной стадии заболевания у детей можут постепенно формироваться асимметрия черепа, и с течением лет лечение становится малоэффективным.

Детям с ВМК предписан массаж кивательной мышцы, назначается специальный комплекс гимнастики. Пораженную мышцу прогревают специальными лампами или грелками. В возрасте ребенка 1,5 — 2 месяца назначают электрофорез с йодистым калием. В некоторых случаях предписывается ношение воротника Шанца.

Огромное значение имеет правильный уход за малышом. Детей не следует до определенного возраста держать в вертикальном положении. При укладывании и купании требуется постоянная поддержка головы.

Электрофорез при кривошее на приборе Элфор — 3 ответов на Babyblog

Нам год и два. Установочная кривошея. Решила приобрести прибор Элфор и делать электрофорез дома сама. Дальше — все подробно. То, чего я не нашла в интернете, когда очень было нужно. Надеюсь, кому-то еще пригодится.

Год назад нам было два месяца, мы жили в мегаполисе и без проблем отходили на электрофорез и массаж. Сейчас мы живем в области, в селе, в частном доме. До местной амбулатории (районное подразделение поликлиники) очень сложно добираться своим ходом, на такси разоришься, и по межсезонью стоять с малышом на остановках по часу-два врагу не пожелаешь и цеплять лишний раз ОРВИ в амбулатории и автобусах не хочется. После долгих раздумий купила прибор для домашнего электрофореза Элфор. Цена смешная. Прибор пригодится всей семье. Его здесь описывать не буду, таких статей много. Напишу конкретно по нашему случаю, что и как мне объяснила медсестра физиотерапевтического кабинета из амбулатории.

Первое, в комплект к прибору не входят прокладки для процедуры. Пишут, что можно использовать марлю или бинт. Нет. Только фланель. Нужно самим изготовить две прокладки. Каждая состоит из пяти сшитых по периметру прямоугольных двойных тряпочек размером 5см на 8см. В верхней предусмотреть кармашек для резиновой штучки с электродом. По торцам эти пять тряпочек в середине перехватить стежком, скрепив таким образом. У вас получилась этакая вафелька из фланели с кармашком на одной стороне. Устанавливать электрод в кармашек нужно сверху, чтобы между кожей и электродом были все эти слои.

Далее берем чистую теплую воду, смачиваем прокладки и отжимаем. На одну из них капаем необходимое лекарство. У нас первый курс с эуфиллином. Я смогла найти в аптеке 2,4%. Невролог нам выписала 1,2%. Вообще его надо заказывать в рецептурном отделе, но здесь с этим проблема. Не страшно! Прокладка у нас уже мокрая, лекарства достаточно налить совсем немного, из ампулы буквально пятую часть. Для эуфиллина без разницы на какой электрод прикладывать лекарство (+ или -). В случае нашей кривошеи смоченную с лекарством прокладку, в которую вставлена резиновая пластина с электродом «+» прикладываем в основании шеи на спине. Вторую прокладку «-«, смоченную только в воде, прикладываем на середину поясницы. (важно — плюс всегда на шею, минус на поясницу) Как вариант можно на грудину, если например наблюдается слабость развития рук. Прокладки крепим эластичными (не резиновыми!) бинтами, ту, что на шее сзади по принципу «рюкзака» перехватывая спереди плечи.

Прибор сначала пробуем на себе, прикладывая прокладку с электродом на шее спереди или на внутреннем сгибе локтя, где наиболее нежные места. Включаем и колесиком определяем нужную силу тока, чтобы не сделать ребенку ожог. Идеально на минимуме, так как от силы тока эффективность не зависит. Когда определились, крепите на ребенка прокладки и включайте прибор. Сила тока минимальная (колесико на минимум), время процедуры 10 минут.

После процедуры прокладки необходимо в течение 1 часа промывать в холодной проточной воде (например, положив в ковшик и открыв кран). После кипятить в течение 30мин. И наконец повесить сушить. На следующий день использовать снова.

Процедуру электрофореза нужно делать через 40 минут после еды. Она оказывает возбуждающее действие, так что перед сном тоже не стоит. Если в этот день еще есть сеанс массажа, то между ними нужно выдержать 4 часа. Если у ребенка повысилась температура, или режутся зубки и он капризничает — процедуру не делать.

Второй курс у нас будет с сульфатом магния. Я купила ампулы 250мг/мл. Этот препарат всегда вводится с электрода «+».

Курсы по 10 сеансов либо делать ежедневно, не пропуская ни дня, один за другим. То есть 20 дней. Либо между курсом эуфиллина и курсом сульфата магния выдержать перерыв 1 месяц.

И в заключение, электрофорез, конечно, штука хорошая. Но в случае с кривошеей основной упор нужно делать на массажи. Они эффективнее.

Лечение кривошеи. Какие методы лечения кривошеи существуют?

• устранение деформации безоперационным методом;
• уменьшение мышечных контрактур и тяжей;
• укрепление мышц шеи на здоровой стороне;
• предупреждение возникновения деформаций структур челюстно-лицевой области.

В Центре клинической постурологии для лечения кривошеи применяются такие методы, как:

Лечебная гимнастика (ЛФК)

Упражнения подбираются соответственно возрасту и развитию пациента с учетом вида кривошеи. Подбор упражнений осуществляется только врачом – самолечение чревато дополнительной травмой шейных мышц.

Гимнастика укрепляет ослабленные мышцы и повышает их сопротивление неправильному положению головы. Устраняется тонический спазм мускулатуры, увеличивается объем движений шейного отдела. Занятия проводятся курсом, улучшение состояния наблюдается на первых неделях лечения.

Массаж

Массаж оказывает положительное воздействие и на здоровые, и на пораженные мышцы. Спазмированные пучки мышц подвергаются релаксирующим приемам для облегчения их последующего растяжения. Здоровая сторона массируется более интенсивно для противодействия насильственному повороту головы в другую сторону. Массажные техники в сочетании с ЛФК делают мышцы шейного отдела эластичными, нормализуют их тонус, активизируют кровообращение в мягких тканях.

Физиотерапия

На ранних стадиях кривошеи эффективен электрофорез с лидазой (ферментный препарат) и йодидом калия. Процедура занимает около 15 минут, полный курс составляет 15-20 сеансов. Улучшить обмен веществ и расслабить поврежденные связки помогают фонофорез, инфракрасное облучение, парафинотерапия. Все физиотерапевтические процедуры дают ожидаемый эффект только при прохождении назначенного курса процедур.

Рефлексотерапия

Врач-рефлексотерапевт воздействует на биологически активные точки различными способами (чаще применяется акупунктура и микротоковая рефлексотерапия) с минимальным болевым раздражением кожи. Методика хорошо сочетается с точечным массажем и физиопроцедурами.

Курс рефлексотерапии состоит из 10-15 процедур с двухдневным перерывом. По его завершению снижается ригидность мышц, устраняются спазмы, мышечные волокна становятся более пластичными и восприимчивыми к дальнейшим восстановительным мероприятиям.

Важную роль играет использование лечебного воротника, правильное ношение и укладывание ребенка, разрабатывание шейного отдела путем стимуляции поворотов головы вслед за игрушками.

Рекомендуем обращаться в Центр клинической постурологии при первых подозрениях на развитие кривошеи в любом возрасте. Раннее начало лечения позволяет предотвратить формирование необратимых нарушений, а также обойтись без операционного вмешательства в подавляющем большинстве случаев.

Острый период заболевания

Мануальная терапия

Мануальная терапия может быть использована
на всех этапах ПЭП, но в остром периоде
она занимает одно из ведущих мест в
комплексной терапии.

Основные задачи мануальной терапии:
улучшение гемодинамикиголовного
мозга за счет повышения кровоснабжения
по позвоночной артерии; улучшение
венозного оттока,снижение внутричерепного
давления;восстановление
корково-подкорковой взаимосвязи, т.е.
нормализация функции стволовых структур
мозга;улучшение функционирования
диафрагмы и других внутренних органов;
ликвидация спастической“кривошеи“,снижение патологического гипертонуса,
улучшение тонуса мускулатуры,укрепление
связочного аппарата позвоночника;улучшение психомоторного развития и
выработка рефлексов; улучшение физического
развития; повышение резистентности
организма и его адаптационных возможностей.

С помощью методик мануальной терапии
может быть устранен подвывих в области
С_1-2ПДС, улучшена гемодинамика, а
тем самым улучшено функционирование
всего виллизиева круга. Мануальные
методики позволяют добиться уменьшения
гипертензионного синдрома, а нередко
и нормализации внутричерепного давления
и венозного кровотока.

В первые 10 дней для устранения болевого
синдрома и восстановления нормального
положения позвонков и формы позвоночного
канала проводится мануальная терапия
с применением “мягкой“щадящей кранио-сакральной техники и
миофасциальное расслабление мышц,
находящихся в состоянии гипертонуса.

Дополнительное воздействие оказывается
на субокципитальный сустав, а также на
область ограничения отведения бедер –
сакро-илиакальный сустав.

Для достижения лечебного эффекта, как
правило, бывает достаточно одной-двух
манипуляций. После этого, в обязательном
порядке проводится иммобилизация
шейного отдела позвоночника и головы,
осуществляемая кольцевидной ватно-марлевой
повязкой на период 2-3 недели.

Поэтому, как самостоятельный метод
лечения, а также в дополнение к мануальной
терапии, на данном этапе лечения
приобретают значение различные
ортопедические методики.

Ортопедические мероприятия

Ортопедические мероприятия имеют
большое значение, причем не только для
профилактики контрактур и деформаций,
но и для лечебного воздействия,
способствующего наилучшему восстановлению
и регулированию произвольной мышечной
деятельности ребенка. Ортопедическое
лечение также содействует нормализации
процессов возбуждения и торможения.

Важно правильное положение ребенка,
как во время сна, так и в часы бодрствования
в любом периоде заболевания.

В острый и ранний восстановительный
период проводится лечение положением:
ребенку необходимо обеспечить правильное
положение в постели. Характер положения
зависит от функционального состояния
мышц. Цель — создать массивное длительное
корригирующее воздействие. Ребенок
должен лежать на ровной, не очень мягкой
постели, голова — на низкой подушке.

Ортопедические укладки следует проводить
только во время дневного, но не ночного
сна, т.к. дети устают находиться в
определенном положении, их сон становится
тревожным.

Лечение положением лучше проводить 3
раза в день: с 11 до 12 часов, с 13 до 14 часов
и с 17 до 18 часов. При наличии нейрогенной
кривошеи можно использовать специальные
“бублики“,
мешочки с песком, воротник Шанца или
укладку по Козловскому, когда два мешочка
с песком располагаются вдоль туловища
от подмышечных впадин до гребней
подвздошных костей для хорошей фиксации,
а третий мешочек с подогретым песком
между нижней челюстью и ключицей на
стороне наклона в положении коррекции.

При повышенном тонусе приводящих мышц
нижних конечностей для разведения ног
используют также мешочки с песком,
подушку Фрейка.

Главное — не производить грубой и
насильственной, длительной гиперкоррекции,
так как мышца в перерастянутом длительном
положении после снятия фиксации реагирует
парадоксально, то есть мышечным спазмом,
усугубляющим еще в большей степени
контрактуру суставов.

В комплексной реабилитации эффективным
методом на ранних этапах лечения и
восстановления является физиотерапия.

Физиотерапия.

Задачи: антигипоксическая и антиишемическая
терапия; оптимизация венозного оттока,
снижение внутричерепного давления;
восстановление корково-подкорковых
взаимосвязей, седативная, спазмолитическая,
рассасывающая и трофикостимулирующая
терапия.

Как метод лечения и реабилитации детей
с наличием перинатальной энцефалопатии,
физиотерапия может быть применена с
первых дней жизни ребенка. Широко
распространенные в последние годы
методики электрофореза эуфиллина наряду
с положительными эффектами (улучшение
насыщения крови кислородом, стимуляция
мозгового кровотока, стимуляция венозного
и лимфатического оттока) могут обеспечить
и такие негативные клинические проявления,
как торпидное течение заболевания у
детей, перенесших внутрижелудочковые
кровоизлияния (эуфиллин является
антиагрегантом), чрезмерно выраженный
эффект вазодилятации, что приводит у
некоторых детей к усугублению венозного
и лимфатического застоя в ЦНС. Вместе
с тем существуют различные альтернативные
возможности проведения лечения методом
электрофореза по глазнично-затылочным
или лобно-затылочным методикам с
введением препаратов:

• меди (сульфата меди), ГОМК, оксибутирата
  натрия при наличии очагов судорожной
  активности,

• магния (сернокислой магнезии) при
  гипертензионно-гидроцефальном синдроме,

• препаратов антифиброзирующей активности:
  протеолитических ферментов – лидазы,
  микроэлементов – йода (калия йодид),
  серы (натрия тиосульфат), церебролизина
  для проведения рассасывающей терапии,

• витамина Е (-токоферола
  ацетата на 2 % ДМСО), меди (меди сульфата),
  витаминов группы В, в частности,
  эмаксипина; никотиновой кислоты,
  эуфиллина — антиоксидантов и стимуляторов
  микроцикркуляторной активности,

• унитиола, тиосульфата натрия, никотиновой
  кислоты, сульфатов меди, магния, цинка,
  вводимых с катода – для стимуляции
  венозного и лимфатического оттока,
  купирования гипертензионно-гидроцефального
  синдрома при явлениях пирамидной
  недостаточности и наличии двигательных
  расстройств,

• аскорбиновой кислоты — с целью
  стабилизации сосудистого тонуса,

• витаминов группы В, эмаксипина — для
  оптимизации проведения нервного
  импульса и профилактики неполноценной
  миелинизации нервных волокон,

• дибазола, папаверина – при спастических
  и вялых парезах, прозерина – при вялых
  и смешанных парезах

Процедуры электрофореза проводятся
при дозировании силы тока для местных
методик, продолжительностью 7 – 8 минут,
в режиме анодизации, предусматривающем
помещение анода (положительного полюса)
в области лба или век при закрытых глазах
и катода (отрицательного полюса) в
шейно-затылочной области. Продолжительность
курса лечения 8 – 10 процедур при проведении
их ежедневно (оптимально) или через
день.

При сочетанном повреждении шейного и
поясничного отделов позвоночника и
выраженных проявлениях
гипертензионно-гидроцефального синдрома,
синдома двигательных нарушений и
гипервозбудимости применяется метод
магнитотерапии – постоянное или
переменное непрерывное магнитное поле
— на область пояснично-крестцового
отдела позвоночника. Дозирование
напряженности магнитного поля проводится
традиционно, с назначением минимальных
значений, продолжительность процедуры
8 минут, процедуры проводятся в режиме
монотерапии или в один день с электрофорезом
(магнитотерапия, затем электрофорез с
интервалом не менее 1 – 1,5 часов между
ними), ежедневно или через день, на курс
до 10 – 12 процедур.

При слабо выраженных патологических
изменениях в области шейного отдела
позвоночника можно ограничиться
применением только метода магнитотерапии.
Курс лечения 10 – 12 процедур при ежедневном
их проведении по 8 — 10 минут.

Светолечение – фотохромотерапия — с
использованием зеленой и синей матрицы
(аппарат «Спектр»), или, соответственно,
зеленого и синего светофильтров (лампы
«Бионикс», «Биоптрон») применяется с
целью оказания седативного и
миорелаксирующего эффектов. Оптимально
назначение непрерывного режима излучения
на воротниковую область, стопы и ладони
с целью проведения общего корригирующего
воздействия на гомеостатические
механизмы. Красная и оранжевая матрицы
или светофильтры используются при
необходимости получения тонизирующего
и трофикостимулирующего эффектов.
Удовлетворительные результаты для
достижения трофикостимулирующего
эффекта могут быть получены и при
использовании желтой матрицы или
светофильтра.

Из рекомендуемых методик следует
отметить:

• рефлекторно-сегментарные, на области
  шейного и верхнегрудного отдела
  паравертебрально и дистальные отделы
  верхних конечностей, а также
  пояснично-крестцового отдела
  паравертебрально и дистальные отделы
  нижних конечностей;

• местные (локальные), на конкретные
  области поражения;

• общего действия, проводимые на дистальные
  отделы конечностей – ладони и стопы,
  или на области воротника, надпочечников,
  эпигастральную область. Нежелательно
  при проведении общих методик стимулирующей
  направленности в течение одной процедуры
  воздействовать более чем на одну зону.

На каждое поле воздействие проводится
в сканирующем или стационарном режиме,
по 1,5–2 — 4 минуты (в зависимости от
избранного стимулирующего или
седатирующего метода), не более2 –3 полей
в течение одной процедуры, при проведении
их ежедневно (оптимально) или через день
и продолжительности курса лечения 5-6
(при проведении стимулирующей терапии)
— 10–12 (при проведении седативной и
миорелаксирующей терапии) процедур.
Проведение инфракрасного облучения
пояснично-крестцовой области и спастичных
групп мышц актуально при
гипертензионно-гидроцефальном синдроме
и синдроме двигательных нарушений и
проводится с использованием ламп
Соллюкс, Минина, инфракрасной матрицы
от аппарата «Спектр». В качестве
альтернативной методики можно проводить
лечение с использованием магнитного
поля и инфракрасного излучения от
аппарата МИЛТА при тех же локализациях
воздействия. Процедуры проводятся
ежедневно или через день, при необходимости
их чередования с электрофорезом, на
курс назначается до 5 – 6 процедур.

Не следует забывать о возможностях
пунктурной физиотерапии (фотохромотерапии,
магнитотерапии, электропунктуры).

Достаточно актуальным является проведение
в остром периоде процедур ароматерапии
с использованием эфирных ароматических
масел белой лилии (при перенесенной
родовой травме), лаванды и пупавки
благородной (при кефалогематоме), цикория
полевого и ломоноса (при синдроме
торможения), тимьянового (при гипотонии),
мимулуса и вербены (при синдроме
гипервозбудимости, затруднении
засыпания), лаванды, розмарина и
апельсинового (при синдроме двигательных
нарушений). Для проведения процедур в
ароматическую смесь добавляется не
более 3 капель каждого эфирного масла.
При лечении пациентов с кефалогематомой,
патологическим гипертонусом мышц
возможна постановка компрессов с
вышеназванными эфирными маслами,
берущимися по 1 капле, помещающимися в
воду с последующим традиционным
приготовлением компресса и его локальной
постановкой. На курс назначается до 10
– 15 процедур ароматерапии и до 2 – 5
компрессов.

Рефлексотерапия

В остром периоде использование
рефлексотерапии мы не рекомендуем.

Кинезотерапия и массаж

Одним из методов, используемых в
комплексной реабилитации детей с ПЭП,
является кинезотерапия.

Задачи
кинезотерапии: нормализация мышечного
тонуса; восстановление безусловных
рефлексов; становление установочных
рефлексов; нормализация функций
дыхательной и сердечно-сосудистой
систем; закаливание; положительное
воздействие на психо-эмоциональное
состояние ребенка.

Начинать занятия лечебной физкультурной
можно с разрешения невропатолога и
врача лечебной физкультуры. Проводить
занятия необходимо под постоянным
врачебным контролем. Врач лечебной
физкультуры определяет последовательность,
сочетанность и характер упражнений
лечебной гимнастики, приемов массажа
и лечения положением, а также количество
повторений упражнений в одной процедуре,
ее продолжительность. Методисту
необходимо следить за самочувствием и
состоянием ребенка. При правильно
проводимом занятии ребенок выглядит
спокойным и веселым, то есть занятия
лечебной гимнастикой, массажем всегда
должны вызывать у него положительные
эмоции. При появлении признаков утомления,
таких как: недовольство ребенка,
возбуждение, ухудшение качества
выполнения упражнений, значительное
отвлечение от занятий, вялость
(пассивность) необходимо уменьшить
нагрузку в занятии. Это возможно сделать
за счет уменьшения времени занятия,
количества повторений упражнений и
приемов массажа, темпа и амплитуды
движений, включения пауз отдыха и
дыхательных упражнений, дробного
проведения основного комплекса в течение
дня и использования исходного положения
преимущественно лежа.

Методика
лечебной физкультуры строится, исходя
из ее задач. Она включает в себя:

1. лечение положением;

2. лечебную гимнастику;

3. плавание.

Методы лечебной физкультуры можно
применять с самого рождения, но чаще
они используются с месячного возраста,
когда проведены реанимационные
мероприятия по ликвидации отека мозга,
снижению повышенного внутричерепного
давления, когда улучшены функции основных
жизненно важных органов и систем. Однако,
с 5-ти дневного возраста, когда заживет
пупочная ранка, возможно грудное плавание
в ванне с температурой воды 36,5^оС в течение 10-15 минут ежедневно или через
день. Из приемов классического массажа
на данном этапе можно использовать
преимущественно поглаживание верхних
и нижних конечностей, мышц спины, ягодиц,
грудной клетки и живота. Длительность
массажа составляет от 5 до 15 минут. Если
массаж назначается в один день с
плаванием, его проводят перед купанием.

Массаж при кривошее у грудничков, лечение массажем кривошеи у детей до года

Как правило, диагноз “кривошея” ставят невролог или ортопед при осмотре малыша в возрасте от месяца до 3-4 месяцев. Но и сами родители могут обнаружить, что малыш смотрит в одну сторону, не любит поворачивать голову в другую, плачет, если сделать это насильно. Так же показателем кривошеи может стать привычный наклон головы в одну из сторон.

Причины кривошеи у грудничков

Причин кривошеи несколько. Самая редкая из них – неправильное развитие позвонков шеи и их деформация. В этом случае кривошея требует хирургического лечения. Второй по частоте причиной кривошеи у малышей до года является установочная кривошея. Она может появиться как внутриутробно (при неравномерном давлении матки на головку малыша – головка устанавливается асимметрично) до неправильного положения ребенка во время кормления, сна или на руках у взрослых. Важно, чтобы на ручках ребенок постоянно менял свое положение, пока мышцы шеи не окрепли. Еще одной причиной может стать травмирование волокон грудинно-ключично-сосцевидной мышцы и разрастание на месте микроразрывов соединительной ткани. В этом случае мышца теряет эластичность, укорачивается и тянет голову в свою сторону.

Массаж новорождённым при кривошее

Лечение кривошеи всегда должно быть комплексным. Массаж при  кривошее нужно проводить,начиная со здоровой стороны. Массаж должен быть дифференцированным: мышцы на стороне кривошеи нуждаются в расслаблении и растягивании, обязательно должны проводиться упражнения для укрепления мышц шеи, спины и рук. 

В случае травматического поражения мышц вместе с массажем эффективно проведение электрофореза с лидазой на область пораженной мышцы.

В некоторых случаях для улучшения трофики назначают электрофорез с эуфиллином на воротниковую зону.

Так же используется лечение положением – как с помощью специальных укладок, так и с помощью правильного положения малыша в кроватке и на руках.
Иногда коррекция кривошеи занимает достаточно длительное время – до года. Но массаж и регулярные упражнения, которым массажист обучает родителей, могут ускорить процесс восстановления.

Вы можете записаться на сеанс массажа
по телефону  8 (812) 962 25 51
или через форму

Физиотерапия – цена за сеанс от 250 р Краснодар

Физиотерапия будит внутренние резервы организма, укрепляет иммунитет и тем самым сокращает сроки лечения, ускоряет заживление ран и воспалений, активизирует важнейшие биохимические процессы в организме, настраивая естественные силы организма на выздоровление.Современные методы физиотерапии обладают ярко выраженным обезболивающим противовоспалительным действием. От своевременности включения физиотерапевтических мероприятий в комплекс лечения нередко зависит исход заболевания в целом.

Физиотерапевтические процедуры назначаются каждому пациенту строго индивидуально с учетом индивидуальных особенностей течения заболевания, его стадии, возраста человека и др. Список заболеваний с применением физиотерапевтических процедур обширный.

В нашей клинике физиотерапию проводит врач физиотерапевт -реабилитолог.

Врач физиотерапевт

Прием врача

Взрослые и дети 0+

Запись по телефону: 8-918-9-555-220

Физиопроцедуры в нашем центре:

Электрофорез лекарственный 

Очень популярный метод физиотерапии с использованием электрического тока.  Преимуществом данного метода является введение лекарственного препарата на прямую в пораженную область через слизистые, не нагружая печень и почки. Благодаря этому и другим своим свойствам электрофорез применяется с первых дней жизни и назначается при широком спектре заболеваний:

• ЛОР органов; 
• дыхательной системы; 
• желудочно-кишечного тракта; 
• неврологических заболеваниях;
• заболеваниях сердечно-сосудистой системы;
• заболеваниях мочеполовой системы; 
• эндокринной системы; 
• заболеваниях опорно-двигательного аппарата и др. 

Основными терапевтическими свойствами лекарственного электрофореза являются: 

• уменьшение воспаления, отеков, болей; 
• расслабление мышц; 
• улучшение микроциркуляции в тканях и их регенерации; 
• расслабляет повышенный мышечный тонус;
• активирует защитные силы организма и др. 

КУФ-терапия — коротковолновое ультрафиолетовое облучение

Терапия посредством использования КУФ – удивительно эффективная физиотерапевтическая процедура, которая при правильном использовании и под постоянным контролем врача приносит огромную пользу для организма. КУФ на аппарате «Солнышко» самое назначаемое терапевтами и педиатрами физиотерапевтическое лечение при инфекционных и вирусных заболеваниях ЛОР органов. Ультрафиолетовое излучение уничтожает вирусы, оказывает бактерицидное воздействие восстанавливает развитие воспалительных процессов.

КВЧ-терапия — крайне высокочастотная терапия

КВЧ терапия это применение волн миллиметрового диапазона с лечебной целью. Это относительно новый и самый перспективный метод физиотерапии. Эти миллиметровые волны осуществляют информационное воздействие на организм за счет внутренних энергетических источников, таким образом действуют локально, а их воздействие не ощущается в привычном понимании.

В основе лечебного действия КВЧ-излучения лежит перестройка конформации структурных элементов кожи и раздражение рецепторов нервных проводников, расположенных в коже. В результате срабатывают кожно-висцеральные рефлексы. При воздействии данного излучения на область локальной болезненности или биологически активные точки рефлекторно изменяется функционирование эндокринной, иммунной и вегетативной нервной системы, повышается неспецифическая резистентность организма к факторам окружающей среды.

Электросон и лекарственный Сонофорез

Электросон или как его еще называют нейросон— еще одна разновидность физиотерапии. Суть его заключается в воздействии на нервную систему человека с помощью низкочастотных импульсных токов. Специальным образом настроенные приборы генерируют токовые импульсы, которые воздействуют на кору головного мозга человека, а так же на подкорковые образования. Такое психофизическое «погружение», вызванное ритмическим воздействием тока и именуется электросном, если применяется лекарственное средство строго по назначению врача, то данная процедура именуются сонофорезом. Помимо излечения заболеваний электросон ускоряет метаболизм, улучшает свертываемость крови, поднимает настроение.

Данная процедура позволяет:

• улучшить кровоснабжение головного мозга;
• восстановить психический, гуморальный и вегетативный баланс;
• нормализовать высшую нервную деятельность;
• улучшить деятельность мочеполовой системы и желудочно-кишечного тракта;
• стимулировать процесс кроветворения и снижать уровень холестерина и др.

Тейпирование

Тейпирование новый безболезненный, неинвазивный и очень хорошо зарекомендовавший себя метод физиотерапии при реабилитации после различный травм, а так же при заболеваниях позвоночника, при лечении ДЦП, остеохондроза, сколиоза, кривошеи и т.п..

Тейпирование — доступныйметодфизиотерапии, которыйможет применяться каксамостоятельно для снятия боли, снятия напряжения с мышц, улучшениялимфотока снятия отека с суставов и др.так иотлично дополняет лечебныймассажиостеопатическое лечение. В нашем центре ГармониЯ физиотрапевт-массажист проводит процедуры:

• спортивноготейпирования;
• лечебно-озроворительноготейпирования;
• эстетиескоготейпирования;
• корректирующегос целью моделирования фигуры.

Цены на услуги физио кабинета

Где можно пройти сеанс физиотерапии в Краснодаре

Мы принимаем по адресу: г. Краснодар, мкр-н Молодежный, ул. 2-я Целиноградская д.44 корпус 2, офис 45 (р-н Витаминкомбината)

Электрофорез для грудничков

В последнее время увеличилось количество диагностирования у детей до года неврологических заболеваний и проблем с опорно-двигательным аппаратом. Для полноценного лечения грудничкам прописывают массаж в комплексе с разными физиопроцедурами (электрофорез, парафин, расслабляющие ванны, УВЧ и другие). Больше всего вопросов возникает при назначении новорожденным электрофореза. Есть мнения, что этот процесс болезненный, бесполезный и даже вредный для маленьких детей. Но эти мнения противоречат вообще принципу работы электрофореза.

Принцип действия электрофореза

Электрофорез – это движение заряженных частиц (ионов) в электрическом поле, способных переносить различные частицы в парообразной или жидкой среде.

А сама физиопроцедура электрофорез, заключается в следующем: на кожу человека с двух сторон кладутся прокладки электродов в ткани, пропитанной лекарственным раствором, где химическое вещество (лекарство) распадается на ионы. При прохождении электрического тока через этот раствор ионы лекарства начинают перемещаться, проникать через кожу, слизистые оболочки, и попадать в организм человека. Лекарство после проникновения в ткани равномерно распределяется в клетках и межклеточной жидкости. Электрофорез доставляет лекарство в эпидермис и дерму, откуда оно всасывается в кровь и лимфу, через которые уже доставляется ко всем органам и тканям, но максимально сохраняется в области введения лекарства.

Известно, что действие лекарств и восприимчивость к ним увеличиваются под воздействием постоянного тока, что помогает добиться максимального эффекта.

Для чего и какой назначают электрофорез для грудничков?

Благодаря тому, что электрофорез имеет противовоспалительное, обезболивающее, успокаивающее и расслабляющее мышцы действие, то его для грудничков назначают в таких случаях:

В зависимости от проблемы для грудничков могут назначать электрофорез с эуфиллином, дибазолом, магнезией, папаверином (на шею при кривошее и для нормализации тонуса всего тела) и кальцием (для формирования костных ядрышек в тазобедренном суставе).

Противопоказания электрофореза для грудничков

Как бы ни безопасна и полезна была бы эта физиопроцедура, но ее категорически запрещено проводить при:

• наличии гнойной инфекции на коже:
• бронхиальной астме в острой форме;
• повышении температуры тела;
• сердечной и почечной недостаточности;
• наличии дерматита или повреждениях кожи в месте наложения.

Как делают электрофорез грудничку в домашних условиях?

Для меньшей вероятности подхватить инфекцию и психического спокойствия грудничка, электрофорез можно проводить на дому. Для этого вам надо купить аппарат, изучить инструкцию и технику безопасности при работе с ним. На первую физиопроцедуру лучше пригласить квалифицированную медсестру, которая вам наглядно покажет весь процесс правильного накладывания. У врача получить предписание с количеством процедур и указанием лекарственного препарата, раствор которого заказывать лучше в аптеке, а не делать самостоятельно. Не проводите сеанс больше положенного времени – для маленьких детей это до 8 минут. Больше — не значит лучше!

Если после начала проведения процедур ваш ребенок стал вести себя хуже, появились проблемы со сном, то значит, ему стоит прервать курс электрофореза. Уже доказано, что все прописанные процедуры лучше работают в комплексе, поэтому электрофорез для грудничков надо обязательно сочетать с массажем и другими процедурами.

Тайна изогнутой клетки Исследование серповидной клетки

Тайна изогнутой клетки: исследование серповидной анемии с помощью модуля гель-электрофореза, разработанного в Медицинской школе Бостонского университета. Представлено доктором Дэном Мюрреем.

Схема серповидноклеточной анемии Центральная догма биологии Генетический код Электрофорез гемоглобина

Серповидно-клеточная анемия

Серповидноклеточная анемия Генетическое заболевание l Гетерозиготные люди — носители l Гомозиготные люди — больной гемоглобин l Обнаруживается в красных кровяных тельцах l Переносит кислород в ткани Результаты SCA от дефектного гемоглобина l Гемоглобины слипаются l Красные кровяные тельца повреждены Осложнения из-за низкого снабжения тканей кислородом l Боль, повреждение органов, инсульты, усиление инфекций и т. Д.Самый высокий уровень заболеваемости среди африканцев и индийцев l Гетерозиготы, защищенные от малярии

Центральная догма биологии

Центральная догма биологии Транскрипция: преобразование информации из ДНК в m. Трансляция РНК: преобразование информации из РНК в белок

Генетический код

Начало генетического кода

Генетический код • Белковые цепи всегда начинаются с Met • 5 3 ориентация соответствует N-членной C-членной ориентации 5 ’m.Последовательность РНК 3 ‘AUG AAC AAU GCG CCG GAA GCG GAG Met — Asn — Asn — Ala — Pro — Glu — Ala — Glu Met — Asn — Asn Met N-конец Последовательность белка C-конец

Гемоглобин

Гемоглобин Многосубъединичный белок (тетрамер) l 2 и 2 субъединицы Гем Один на субъединицу l Имеет атом железа l Переносит O 2 l в эритроцитах

Серповидноклеточный гемоглобин нормальный m. РНК Нормальный белок GUG CAC CUG ACU CCU GAG AAG val his leu thr proglu lys 1 2 3 4 5 6 7 8 Мутация (в ДНК) Мутант m.РНК Мутантный белок GUG CAC CUG ACU CCU GUG GAG AAG val his leu thr pro val glu lys 1 2 3 4 5 6 7 8 Глутамат (glu), отрицательно заряженная аминокислота, заменяется валином (val), который не имеет заряда. .

Гемоглобин серповидных клеток Значительное изменение структуры, вызванное единственной мутацией

Возможное лекарство от серповидной анемии? Во время внутриутробного развития другой ген (гамма) продуцирует гемоглобин. Экспрессия гамма-гена прекращается естественным образом во время развития. Научные усилия, направленные на прекращение молчания гамма-гена, могут обеспечить пациентов с серповидноклеточными клетками с хорошим гемоглобином

Электрофорез

Метод гель-электрофореза для разделения молекул (ДНК, белков и т. Д.).) на основе физических или химических свойств, таких как: (1) размер (2) форма (3) электрический заряд

Электрофорез ДНК Гели состоят из загруженных образцов агарозной или полиакриламидной ДНК, приложенного напряжения Отрицательно заряженная ДНК перемещается к электроду «+» Меньшие фрагменты ДНК перемещаются быстрее

Электрофорез белков Более сложный, чем электрофорез ДНК. Различные белки имеют разные заряды l Белки сильно различаются по форме l Полиакриламид обычно представляет собой гелевую среду

Белковый электрофорез Неденатурирующие условия Неденатурирующие (нативные): без предварительной обработки белков перед электрофорезом l l l Белки сохраняют нормальную форму Белки сохраняют нормальный заряд Белки, разделенные на основе заряда, размера и формы Название Заряд Масса Белок Q +2 30 k.D Белок R 4 42 к. D Форма

Неденатурирующий электрофорез нормального и мутантного гемоглобина Заряд, размер, форма Q. Какие из вышеперечисленных свойств будут отличаться для нормального гемоглобина (Hg. A) и мутантного гемоглобина (Hg. S)? A. Заряд: Да, Hg. A имеет на один «-» больше, чем Hg. Размер S.: Нет, рт. А и Hg. S того же размера. Форма: Да, формы разные.

Скорость миграции нормального и мутантного гемоглобина Какая ртуть мигрирует быстрее во время электрофореза? Нормальный мутант (Hg.A) (Hg. S) Размер заряда Форма Причина Hg. У A на один «» больше, чем у Hg. S NA Аминокислоты Val и Glu примерно одинакового размера NA Hg. Более компактный, чем Hg. S

Структура белка

Структура белка 1 = Первичная структура 2 = Вторичная структура 3 = Третичная структура 4 = Четвертичная структура

Определение первичной структуры — Последовательность аминокислот в белке Пример — Первичная структура фермента лизоцима: 1 2 3 4 5 126 127 128 129 Lys-Val-Phe-Gly-Arg.. . Gly-Cys-Arg-Leu Примечание. По соглашению, аминокислотные последовательности пишутся, начиная с аминоконца.

Определение вторичной структуры — Регулярные паттерны относительно небольших сегментов белка, удерживаемых вместе в основном Н-связями. Примеры: -спиральная -структура http: // www. ультранет. com / ~ jkimball / Биология. Страницы / S / Secondary. Состав. html

Определение третичной структуры — Общая трехмерная форма белка. Два основных типа — шаровидные и волокнистые. Примеры: Глобулярные (пепсиновые) волокнистые (коллагеновые) http: // www.ультранет. com / ~ jkimball / Биология. Phttp: // dwb. unl. edu / Teacher / NSF / C 10 Links / main. хим. охиу. edu / ~ wathen / chem 302 / протеин. htmlages / S / Secondary. Состав. html

Определение четвертичной структуры — Общая трехмерная форма мультисубъединичного белка Пример: гликогенфосфорилаза мышц кролика

Все уровни структуры http: // sosnick. учикаго. edu / precpquastru. html

Белковый электрофорез Условия денатурирования Белки, обработанные SDS (анионным детергентом) перед электрофорезом (SDS-PAGE) l Молекулы SDS связываются с белком l Белки теряют нормальную форму l Все белки имеют одинаковое отношение заряда / массы l Белки разделяются только по размеру Масса заряда +3 30 к.Д 4 42 к. D Заряженная масса SDS-обработка 300 30 k. Д 420 42 к. D

студентов округа Дэви должны решить? Кривую ячейку? Тайна на борту научного автобуса Destiny

Представители СМИ приглашаются для практических занятий наукой на борту одного из университетов Северной Каролины в двух передвижных научных лабораториях Чапел-Хилл, когда он посетит среднюю школу округа Дэви на следующей неделе.

Представители СМИ приглашаются для практических занятий наукой на борту одного из университетов Северной Каролины в двух передвижных научных лабораториях Чапел-Хилл, когда он посетит среднюю школу округа Дэви на следующей неделе.

Вторник (3 ноября)
с 10:10 до 11:40
с 11:45 до 13:20
Средняя школа округа Дэви
1200 Солсбери-роуд, Моксвилл
Студенты-биологи Дженнифер Ричардсон выполнят лабораторное упражнение под названием «Тайна изогнутой клетки». Студенты откроют для себя молекулярные основы серповидно-клеточной анемии, используя гель-электрофорез в качестве диагностического инструмента для дифференциации нормального гемоглобина от гемоглобина, обнаруженного у людей с серповидно-клеточной анемией.

Программа обучения науке «Путешествие судьбы» — это научно-образовательная инициатива планетария и научного центра Морхед в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл, обслуживающая учителей и студентов до колледжа по всей Северной Каролине. Destiny разрабатывает и предлагает основанные на стандартах практические учебные программы и профессиональное развитие учителей с командой преподавателей и автопарком, которые путешествуют по всему штату.

Destiny and Discovery, два 40-футовых автобуса, изготовленных по индивидуальному заказу, оборудованные как мобильные научные лаборатории, доставляют передовое научное и технологическое оборудование студентам, которые в противном случае могли бы не увидеть высокотехнологичные эксперименты или то, что может предложить карьера в науке.Мобильные научные лаборатории представляют собой мощные визуальные образы, которые повышают осведомленность общественности о важности и финансировании, необходимом для качественного научного образования.

Чтобы иметь право запросить посещение мобильной научной лаборатории Destiny, каждый участвующий преподаватель должен посетить семинары, чтобы узнать, как включить модульные упражнения и эксперименты в свой класс. Destiny предлагает 15 различных научных модулей, каждый из которых соответствует стандартному курсу обучения NC.

Программа Destiny была создана UNC-Chapel Hill в 2000 году.Его основными спонсорами являются штат Северная Каролина и GlaxoSmithKline при дополнительной поддержке со стороны Bio-Rad Laboratories и Биотехнологического центра Северной Каролины. С 2006 года Destiny является частью планетария и научного центра Морхед.

Веб-сайт Destiny : www.moreheadplanetarium.org/go/destiny
Контактное лицо Destiny со СМИ : Карен Корнегай, (919) 843-7952, [email protected]

Контактное лицо службы новостей : Сьюзан Хьюстон, (919) 962-8415, susan_houston @ unc.edu

Метод улавливания и разрешения белковых комплексов в биологических образцах

J Vis Exp. 2017; (123): 55341.

Тайлер Райнсмит

¹ Физиология, Университет штата Мичиган

Брайан А. Киллингер

² Центр нейродегенеративных наук Институт Ван Андел

Ахил Шарма

Akhil Sharma

Akhil Sharma

Akhil Sharma

Государственный университет Уэйна

Анна Мощинска

³ Фармацевтические науки, Государственный университет Уэйна

¹ Физиология, Университет штата Мичиган

² Центр нейродегенеративных наук Институт Ван Андела

^{3 Университет}

Авторские права © 2017, Журнал визуализированных экспериментов

Реферат

Существует множество хорошо разработанных методов очистки и изучения отдельных белков и пептидов.Однако большинство клеточных функций осуществляется сетями взаимодействующих белковых комплексов, которые часто трудно исследовать, поскольку их связывание нековалентно и легко нарушается методами очистки. В этой работе описан метод стабилизации и отделения нативных белковых комплексов от немодифицированной ткани с использованием двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Лизат ткани наносят на неденатурирующий полиакриламидный гель с природным синим цветом, затем прикладывают электрический ток до тех пор, пока белок не переместится на небольшое расстояние в гель.Затем полоска геля, содержащая мигрировавший белок, вырезается и инкубируется с амино-реактивным сшивающим реагентом дитиобис (сукцинимидилпропионат), который ковалентно стабилизирует белковые комплексы. Полоску геля, содержащую сшитые комплексы, затем отливают в полиакриламидный гель додецилсульфата натрия, и комплексы полностью разделяют. Этот метод основан на методах и материалах, знакомых большинству молекулярных биологов, а это означает, что он недорогой и простой в освоении. Хотя он ограничен в своей способности адекватно разделять чрезвычайно большие комплексы и не был повсеместно успешным, этот метод смог захватить широкий спектр хорошо изученных комплексов и, вероятно, применим ко многим интересующим системам.

Ключевые слова: Биохимия, Выпуск 123, Гель-электрофорез, белковые комплексы, разделение, сшивание, мультимеры, PAGE

Введение

Нормальная клеточная функция зависит от белок-белковых взаимодействий1,2. В результате заболевания человека часто сопровождаются нарушениями сборки и поведения различных белковых комплексов3. Поэтому способность охарактеризовать такие взаимодействия имеет решающее значение. Современные средства обнаружения этих взаимодействий требуют очистки белков-мишеней, часто с последующим удалением их взаимодействующих партнеров.Обычная очистка осуществляется дифференциальным центрифугированием, осаждением и / или хроматографией4. Эти методы требуют много времени, их необходимо изменять для каждого целевого белка, и они часто приводят к низким выходам. Современные методы очистки включают слияние пептидных меток с белками-мишенями с последующей иммунопреципитацией или экстракцией на колонках, загруженных шариками, связанными с молекулой захвата5,6. Хотя это можно распространить на многие белки, это требует модификации последовательности мишени, что может привести к конструкциям, различающимся по аффинности к своим обычным партнерам по связыванию.Из-за деликатного характера некоторых белок-белковых взаимодействий этот метод может быть неприменим во многих сценариях. Кроме того, анализы «выпадающего списка», используемые для картирования белок-белковых взаимодействий, могут не отражать точную клеточную картину из-за ограниченных степеней свободы и ненативных уровней белка-приманки.

В идеале белковые комплексы могут быть обнаружены в их нативном состоянии без необходимости очистки или извлечения. Электрофорез в голубом природном полиакриламидном геле (BN-PAGE) был разработан как менее денатурирующая альтернатива электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и позволяет отделить некоторые белки и комплексы от биологических образцов7.Однако белки в BN-PAGE разделяются на основе большого количества переменных, включая размер, заряд, трехмерную структуру и ассоциацию с другими молекулами. Взаимодействие этих факторов часто приводит к совместному разделению белков, образованию агрегатов и плохому разрешению белковых полос. Двумерный электрофорез в нативном полиакриламидном геле решает некоторые, но не все, из этих проблем8.

Чтобы избежать осложнений, связанных с нативным разделением, некоторые авторы используют амино-реактивные сшивающие реагенты, такие как дитиобис (сукцинимидилпропионат) (DSP), для захвата белковых комплексов в тканевых лизатах4.Эти обработанные лизаты затем можно денатурировать и разделить с помощью SDS-PAGE, сохраняя естественный размер и состав белковых комплексов. Однако, поскольку сшивающие реагенты реагируют на основе близости одной молекулы к другой, а белки в лизатах тканей имеют много степеней свободы и могут стохастически взаимодействовать, неспецифическое фоновое сшивание может быть высоким, особенно в концентрированных образцах. Это может привести к трудным для интерпретации результатам.

Здесь мы демонстрируем использование гибридного метода BN-PAGE / SDS-PAGE, называемого электрофорезом в мультимерном полиакриламидном геле (мультимер-PAGE), для разделения и обнаружения белковых ансамблей в сложных смесях.Первоначально клеточный лизат суспендируют в полиакриламидном геле с помощью BN-PAGE. Затем содержащий лизат гель реагирует с поперечно-сшивающим реагентом DSP. Псевдоиммобилизованные и слегка разделенные на геле белки с гораздо меньшей вероятностью будут реагировать неспецифически, что означает снижение фоновой реакционной способности сшивающего линкера. После сшивания полосы геля вырезают и разделяют с помощью SDS-PAGE. Затем полученный гель можно анализировать любыми способами, обычно связанными с электрофорезом в полиакриламидном геле.Этот метод позволяет разделять и обнаруживать комплексы нативных белков в немодифицированном тканевом лизате без необходимости дополнительной очистки или очистки.

Протокол

1. Подготовка ткани

1. Приготовьте 10 мл 4x буфера для образцов BN-PAGE (200 мМ бис (2-гидроксиэтил) аминотрис (гидроксиметил) метан (бис-трис), 200 мМ NaCl, 40 % мас. / об. глицерина, 0,004% Ponceau S, pH 7,2). ПРИМЕЧАНИЕ. Этот основной раствор можно приготовить заранее и хранить при 4 ° C.

2. Разбавьте 250 мкл 4x буфера для образцов в 750 мкл dH ₂ O, содержащем 1x коктейль коммерческих ингибиторов протеазы.Перемешайте и охладите на льду.

3. Гомогенизируйте 20 мг ткани-мишени в 1 мл ледяного буфера для образцов BN-PAGE с помощью 30 движений чистого гомогенизатора Даунса. ПРИМЕЧАНИЕ. Для этого демонстрационного эксперимента целевая ткань — это цельная ткань головного мозга крысы. После гомогенизации образцы можно обработать мягким детергентом, таким как 2% дигитонин, для растворения и проведения электрофореза мембранных белков.

4. Перенесите гомогенат в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и центрифугируйте при 14000 x g в течение 30 минут для осаждения нерастворимого клеточного содержимого.После центрифугирования слить супернатант в чистую пробирку на льду.

5. Следуйте инструкциям производителя для измерения концентрации белка в супернатанте с помощью бицинхониновой кислоты (BCA) или аналогичного количественного анализа белка.

6. Если образец (образцы) гомогената содержат детергент, добавьте 5% кумасси синего G-250 в водном растворе, достаточное для доведения раствора гомогената до 0,25% кумасси.

2. BN-PAGE

1. Разбавьте 25 мл 20x синего нативного (BN) буфера для электрофореза (1.0 M бис-трис, 1,0 M трицин, pH 6,8) в 475 мл dH ₂ O, содержащего 0,002% кумасси синего, чтобы получить 500 мл 1x рабочего буфера.

   1. Если образцы содержат детергент, вместо этого сделайте 250 мл 1x рабочего буфера, содержащего 0,02% кумасси, и еще 250 мл, не содержащего его.

2. Холодильный буфер (и) до 4 ° C.

3. Очистите и соберите кассету для заливки полиакриламидного геля в соответствии с инструкциями производителя.

4. Залейте полиакриламидный гель BN (3% Т-образный слой, 6% Т-разделительный слой) в соответствии со стандартным рецептом7 и поместите гребенку.

5. После полимеризации гелей промойте кассету с dH ₂ O и соберите устройство для электрофореза в соответствии с инструкциями производителя.

6. Удалите гребешок для лунок и заполните лунки 1 рабочим буфером BN-PAGE. Избегайте заполнения всей внутренней камеры буфером до загрузки образцов.

   1. Если образцы содержат детергент, заполните лунки буфером, содержащим 0,02% кумасси синего. ПРИМЕЧАНИЕ: выполните шаги 2.7-2,9 при 4 ° С.

7. С помощью наконечников для загрузки геля внесите пипеткой объем гомогената, содержащий 20 мкг белка, в нужные лунки. Внесите пипеткой эквивалентный объем 1x буфера для образцов BN-PAGE в любые неиспользуемые лунки. ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте концентрацию белка, определенную с помощью анализа BCA, для расчета соответствующего объема гомогената для добавления в лунки.

8. После загрузки образцов заполните внутреннюю камеру рабочим буфером 1x BN-PAGE. Убедитесь, что гель полностью погружен в буфер.Затем заполните внешнюю камеру 1x рабочим буфером до уровня, указанного производителем.

   1. Если образцы содержат детергент, заполните внутреннюю камеру 1x буфером, содержащим 0,02% Coomassie Blue, а внешнюю камеру 1x рабочим буфером без красителей.

9. Подключите электроды к источнику питания и проведите электрофорез белков в геле при 150 В, пока полоса красителя не перейдет на ~ 2 см в разрешающий слой. Остановите и отключите питание.

3. Сшивание

ПРИМЕЧАНИЕ. Выполните шаги 3.1–3.6 при 4 ° C.

1. Разберите аппарат для электрофореза и отделите стеклянные панели кассеты с гелем. Удалите и выбросьте укладывающийся слой.

2. Осторожно разрежьте гель чуть ниже нижнего края лицевой стороны красителя. Постарайтесь сделать этот разрез как можно более гладким и прямым, а затем выбросьте неиспользованный кусок геля. В результате останется горизонтальная полоска полиакриламидного геля шириной ~ 2 см, которая будет содержать весь белок в образце гомогената.

3. Обрежьте все неиспользованные части по краям гелевой полоски.

4. Осторожно поместите полоску в 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в небольшом контейнере и осторожно перемешайте нутацией в течение 30 минут для достижения равновесия.

5. После уравновешивания выбросьте и замените PBS еще 10 мл. Внесите пипеткой 500 мкл 25 мМ DSP, растворенного в диметилсульфоксиде, в PBS и продолжайте перемешивание, как указано выше (шаг 3.4) в течение 30 минут.

6. Слейте раствор DSP.Добавьте 10 мл 0,375 М трис (гидроксиметил) аминометана гидрохлорида (Трис-HCl), pH 8,8, содержащего 2% додецилсульфат натрия (SDS), чтобы погасить непрореагировавший DSP. Продолжить нутацию 15 мин.

4. SDS-PAGE

1. Пока гелевая полоска гаснет, приготовьте гелевые растворы SDS-PAGE стандартными методами9. Не добавляйте реагенты для полимеризации.

2. После закалки верните полоску ΒΝ геля к комнатной температуре и отлейте полоску в новую кассету с гелем.

   1. Для этого осторожно возьмите гель и поместите его на чистую распорную пластину кассеты с гелем.

   2. Сориентируйте полоску так, чтобы нижняя часть лицевой стороны красителя была ближе всего к верхней части новой кассеты (, т.е. , сторона, которая прошла дальше всего во время BN-PAGE, должна быть ближе всего к верхней части новой кассеты; гелевая полоска следует перевернуть от его предыдущей ориентации). См. Рисунок 3 .

   3. Поместите полосу так, чтобы ее верхний край находился на одном уровне с верхним краем крышки ( i.е. , он будет наверху нового геля). Убедитесь, что передняя часть красителя параллельна горизонтальным краям стеклянной пластины.

   4. Прижмите одну сторону вырезанной полоски к одной из разделительных стенок, оставив место с другой стороны для заливки геля и загрузки стандарта белка или лестницы.

   5. Если нижний край полоски геля содержит неровности или неровности, осторожно срежьте их. Если они присутствуют, они будут задерживать пузырьки во время заливки геля.

   6. После того, как гелевая полоска установлена ​​правильно, положите защитную пластину на распорную пластину. Слегка надавите, чтобы вытолкнуть застрявшие пузырьки воздуха.

   7. Продолжайте сборку устройства для заливки геля в соответствии с инструкциями производителя.

3. Добавьте реагенты для полимеризации в раствор гелевого буфера и перелейте его в подготовленную кассету с гелем, используя серологическую пипетку. Заполните кассету с гелем примерно на 2 см ниже вырезанной полоски геля BN-PAGE, чтобы оставить место для укладывающегося слоя.

4. Добавьте 100 мкл бутанола поверх налитого геля и дайте 30 мин для полимеризации разделяющего слоя. Слить бутанол.

5. Добавьте реагенты для полимеризации в раствор укладывающегося геля. Используя серологическую пипетку, залейте укладываемый слой так, чтобы заполнить все оставшееся пустое пространство в кассете с гелем.

   1. Наклоняйте кассету с гелем во время заливки укладываемого слоя, чтобы он заполнил пространство под гелевой полоской и не задержал пузырьки воздуха.

   2. По мере того, как накопительный гелевый буфер заполняет пустое пространство под гелевой полоской, постепенно возвращайте гелевую кассету на ровное основание.

   3. Продолжайте заполнять пустое пространство рядом с вырезанной полоской геля накопительным гелевым буфером, пока он почти не переполнится.

6. Дайте укладывающемуся слою полимеризоваться в течение 30 мин. ПРИМЕЧАНИЕ. Сделайте 10-кратный рабочий буфер SDS-PAGE (250 мМ трис (гидроксиметил) аминометан (трис), 1,9 М глицин, 1% SDS) во время полимеризации геля.Это также можно сделать заранее и хранить при комнатной температуре.

7. Разбавьте 50 мл рабочего буфера 10X SDS-PAGE в 450 мл dH ₂ O, чтобы получить 1 рабочий буфер.

8. После полимеризации укладываемого слоя извлеките кассету с гелем из разливочного устройства, промойте dH ₂ O и соберите устройство для электрофореза в соответствии с инструкциями производителя.

9. Заполните внутреннюю камеру полностью 1x рабочим буфером SDS-PAGE, затем заполните внешнюю камеру до уровня, указанного производителем.

10. Загрузите пространство рядом с вырезанной гелевой полоской шкалой молекулярной массы или подходящим белковым стандартом.

11. Подключите электроды к источнику питания и проведите электрофорез образцов при 120 В. Когда краситель Кумасси стекает с геля, остановите и отключите источник питания.

12. Проанализируйте гель, используя стандартные методы электроблоттинга и обнаружения белков по связыванию антител10.

Репрезентативные результаты

В этом демонстрационном эксперименте мультимерный ПААГ проводили на лизате цельного мозга крысы.Полученные разделенные белки наносили на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF), а затем зондировали антителами против белков, которые, как известно, образуют комплексы. На рисунке 1 показана проверка протокола двумя способами. Во-первых, мы демонстрируем, что сшитые белки поддаются расщеплению при добавлении восстанавливающего агента, что означает, что наблюдаемые частицы с более высокой молекулярной массой образуются сшивающим реагентом и не связаны с каким-либо другим компонентом протокола ( Рисунок 1A ).Во-вторых, мы демонстрируем, что сшивание чувствительно к добавлению детергентов (, рис. 1В, ), что означает, что сшивание специфично для комплексных белков и что случайная реактивность из-за непосредственной близости на геле минимизирована. Рисунок 2 демонстрирует, что метод не может захватить респираторный комплекс II, но в остальном имеет широкое применение для захвата как растворимых, так и мембраносвязанных комплексов.

Рисунок 1: Валидация метода multimer-PAGE. ( A ) Захват белковых комплексов путем поперечного сшивания в геле с DSP чувствителен к расщеплению дитиотретолом (DTT).Мультимерный ПААГ выполняли на лизате цельного мозга крысы без (А1) или с (А2) 5 мМ дитиотретола, включенного в раствор для гашения Трис / ДСН. Гель наносили электроблоттингом на мембраны из ПВДФ, а затем исследовали на наличие тяжелой цепи кинезина. Полоса с высокой молекулярной массой наблюдается на обеих мембранах, вероятно, соответствующая всему комплексу моторного белка кинезина или его части. На блоте, обработанном DTT, имеется дополнительная полоса при 126 кДа, молекулярная масса пептида тяжелой цепи кинезина. Дитиотреитол является восстанавливающим агентом и способен восстанавливать сшивание путем разрыва дисульфидной связи, присутствующей в DSP.Следовательно, агрегат кинезина чувствителен к расщеплению DTT. ( B ) Захват белкового комплекса чувствителен к добавлению денатурирующих детергентов. Мультимерный ПААГ выполняли на лизате цельного мозга крысы, как описано в тексте, за исключением того, что к образцам лизата добавляли возрастающие количества (от 0 до 2%) SDS (слева) или Triton X-100 (справа), а затем инкубировали на льду. за 30 мин до нанесения первого геля. Конечные гели наносили на мембраны из ПВДФ и исследовали на наличие α-синуклеина. Наблюдаются по крайней мере три полосы возрастающей молекулярной массы, соответствующие мономеру, тетрамеру и октамеру α-синуклеина соответственно.Интенсивность сигналов олигомерных полос уменьшается с увеличением концентрации детергента, указывая на то, что эффективность перекрестного сшивания зависит от конформации нативного белка. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Демонстрация захвата белковых комплексов с использованием мультимер-PAGE. ( A ) Растворимые и мембраносвязанные белковые комплексы были захвачены из (A) лизата цельного мозга крысы или лизата ( B ), инкубированного с 2% дигитонином в течение 1 ч при 4 ° C, путем проведения мультимер-ПААГ, как описано в тексте.Затем гели подвергали блоттингу, и мембраны PVDF исследовали на предмет компонентов различных комплексов. На мембране, исследуемой на наличие ацетилированного тубулина, который, как известно, стабилизирует микротрубочки, наблюдаются высокомолекулярные частицы. Динеин и кинезин представляют собой мультисубъединичные комплексы моторных белков с молекулярными массами 1,5 и 380 кДа соответственно. Мембраны, промокшие для компонентов этих комплексов, показывают высокомолекулярные частицы. Кроме того, мультимер-PAGE успешно захватил димер HSP90.α-Синуклеин образует тетрамеры и октамеры, а также нейротоксические высокомолекулярные олигомеры. На промокательной мембране видны октамер и полоса более тяжелых видов. Также наблюдается димеризация VDAC. На мембранах обнаруживаются высокомолекулярные частицы, содержащие компоненты митохондриальных комплексов I и IV. Однако мембранный блоттинг на SDHA, член комплекса II, не демонстрирует какой-либо подходящей высокомолекулярной полосы. AcetTUB: ацетилированный α-тубулин; βTUB: β-тубулин; Динеин: тяжелая цепь динеина; HSP90: белок теплового шока 90; Кинезин: тяжелая цепь кинезина; NDUFS3: железо-серный центр 3 митохондриального комплекса I; VDAC: порин; SDHA: сукцинатдегидрогеназа митохондриального комплекса II; COXIV: цитохром С-оксидаза митохондриального комплекса IV.Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Общая блок-схема multimer-PAGE. ( A ) Приготовьте лизат ткани, используя неденатурирующие методы, такие как гомогенизация в буфере для образцов BN-PAGE. ( B ) Внесите лизат в гель BN-PAGE, затем проведите электрофорез (150 вольт) в рабочем буфере BN-PAGE. Позвольте образцу переместиться до тех пор, пока фронт красителя не переместится на ~ 2 см в растворяющийся гель. ( C ) Удалите слой наложения и неиспользованную часть разрешающего слоя.( D ) Погрузите полоску геля в PBS и уравновесите встряхиванием в течение 30 мин. ( E ) Удалите PBS и снова погрузите гелевую полоску в PBS, содержащий 2,5 мМ DSP. Взбалтывать 30 мин. ( F ) Удалите раствор DSP, затем снова погрузите гелевую полоску в 375 мМ Трис, содержащий 2% SDS, и встряхивайте в течение 30 мин. Комплексы, присутствующие в гелевой полоске, теперь стабилизируются за счет сшивания. ( G ) Поверните полоску геля на 180 ° и отлейте в новый гель SDS-PAGE. Включите слои наложения и разрешения.( H ) Растворите образец электрофорезом (120 вольт). ( I ) Удалите гелевую полоску и укладывающийся слой, затем при необходимости проанализируйте разделяющий слой. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Белковые взаимодействия важны для каждой задачи, которую выполняют живые существа. Из-за этого они являются предметом тщательного изучения и исследования. Мультимер-ПААГ — это новый метод захвата, разделения и анализа широкого спектра белковых комплексов.Ранее мы продемонстрировали его применимость для изучения олигимеризации ассоциированного с заболеванием белка α-синуклеина11. Однако его можно расширить для многих белковых комплексов, как показано на , рис. 2, . По сравнению с другими методами изучения белковых комплексов, мультимер-PAGE выгоден своей простотой и краткостью. Время от образца ткани до полного отделения геля SDS составляет приблизительно 8 часов. Так как обнаружение может быть выполнено с помощью типичного вестерн-блоттинга, протокол может быть выполнен на немодифицированном тканевом лизате с пределами обнаружения, намного более низкими, чем те, которые связаны с экспериментами с методом pull-down.Кроме того, большинство хорошо оборудованных лабораторий молекулярной биологии смогут применять этот метод с небольшими первоначальными вложениями. Как обсуждается ниже, большая часть проблем, связанных с мультимер-PAGE, связана с поиском неисправностей и оптимизацией метода для каждого изученного белкового комплекса.

Хотя мультимер-PAGE должен быть доступен для большинства молекулярных биологов, его успех зависит от навыков и опыта исследователя. Крайне важно, чтобы резка и повторная заливка полоски геля BN в новый гель SDS выполнялись с осторожностью.Важно ориентировать полоску геля так, чтобы электрофорез заставлял белки мигрировать в гель SDS в виде параллельных полос. Если полоска геля отлита криво, полосы белка будут перемещаться друг в друга, и данные будут потеряны. Не менее важно, особенно для больших комплексов, вращение полоски геля перед заливкой ее в гель SDS-PAGE. Это дает более крупные комплексы, которые, возможно, не очень далеко переместились в гель BN-PAGE, больше времени для втягивания в разделяющий слой геля SDS-PAGE.Важно отметить, что изменения размера и физических характеристик белка, вызванные сшивкой, также следует учитывать во время анализа. Например, некоторые низкомолекулярные белки, такие как α-синуклеин, плохо удерживаются на мембранах PVDF, но их поперечно-сшитые олигомеры удерживаются. Это может затруднить сравнительный анализ и должно быть принято во внимание.

При первом разделении комплекса с помощью multimer-PAGE важно проверить метод. Мы предлагаем три теста для проверки / устранения неполадок.Во-первых, убедитесь, что представляющий интерес пептид мигрирует в гель BN, следуя протоколу мультимерного PAGE до иссечения гелевой полоски, затем остановите, поместите полоску на мембрану PVDF и зондируйте интересующую субъединицу. Если сигнал отсутствует, вероятно, комплекс не переместился в гель BN, а это означает, что он должен быть более пористым, или образец должен пройти дальше в разделяющий слой. Наличие сигнала подтверждает, что по крайней мере несвязанная субъединица мигрировала в гель. На данном этапе подтвердить наличие полного комплекса будет сложно.Если в гелевой полоске BN обнаруживаются признаки субъединицы, переходите ко второму тесту. Выполните мультимерный PAGE без стадии перекрестного связывания, затем проведите блоттинг на мембране PVDF и зонд для субъединицы. Субъединица должна денатурировать в присутствии SDS и нормально мигрировать в гель SDS. Если этого не происходит, вероятно, проблема связана с методикой исследователя. Полоска геля BN могла быть плохо разрезана, оставив некоторое количество белка, или гель SDS мог быть отлит неправильно. Наконец, выполните мультимерный PAGE с включенной стадией расщепления сшивающего агента, затем проведите блоттинг и зонд, как описано на , рис. 1, .Это подтверждает, что агрегация комплекса происходит из-за добавления DSP, а не является неожиданным следствием какой-либо другой части протокола multimer-PAGE. Расщепление должно приводить к полосе агрегата пониженной интенсивности и полосе мономера субъединицы повышенной интенсивности при визуализации. Если полоса агрегата не наблюдается при нормальном мультимерном PAGE, но полоса мономера увеличивается по интенсивности при расщеплении DSP, комплекс, вероятно, добрался до геля SDS, но не смог мигрировать в разделяющий слой.

В своем нынешнем состоянии мультимер-PAGE применим ко многим белковым комплексам, но не является универсальным протоколом.Вероятно, его необходимо модифицировать для каждого интересующего комплекса. Одна из распространенных проблем показана на рисунке 2: захваченные комплексы часто настолько велики, что почти не мигрируют на SDS-PAGE. Этим можно управлять, изменяя пористость геля SDS или проводя электрофорез в течение более длительных периодов времени. Дополнительным осложнением является случайное появление на геле более двух полос. Неполная реакция со сшивающим агентом может привести к распределению полос промежуточной молекулярной массы13.Это может затруднить определение того, являются ли множественные полосы репрезентативными для физиологически важных олигомерных промежуточных продуктов или просто непреднамеренными последствиями частичного поперечного сшивания. Для мембранных белков, которые необходимо солюбилизировать перед анализом, также важно учитывать влияние выбора детергента на поведение белковых комплексов. Детергент, используемый для солюбилизации мембранных белков, влияет на их конформации, ассоциации с партнерами по связыванию и функции 14,15.Выбор моющего средства также влияет на эффективность поперечного сшивания16. Таким образом, вероятно, что идеальные условия растворения будут варьироваться в зависимости от изучаемого комплекса.

Multimer-PAGE иногда не может захватить комплекс, как показано на блоте SDHA на рисунке 2. Сукцинатдегидрогеназа является частью митохондриального комплекса II массой 124 кДа, который достаточно мал, чтобы легко перемещаться в гель. То, что он не был обнаружен, указывает на то, что multimer-PAGE не смог его захватить. У таких случаев есть много возможных объяснений.Большинство сшивающих реагентов содержат два реактивных конца, которые образуют ковалентные связи с боковыми цепями аминокислот. Эффективность, с которой сшивающие реагенты захватывают белковые комплексы, зависит от их доступности для реактивных остатков. В случае DSP сшивание осуществляется ацилированием первичных и вторичных алифатических аминогрупп, подверженных действию растворителя, обычно ε-аминогрупп лизина17. Остатки лизина обычно находятся на поверхности белка, но их случайная секвестрация в гидрофобных центрах снижает эффективность поперечного сшивания13.Субъединицы комплекса II похоронены в митохондриальной мембране и могут оставаться недоступными для DSP даже после солюбилизации дигитонином 18. Очень большие и плотно упакованные комплексы, такие как амилоидные олигомеры, также могут ограничивать доступность поверхностных остатков лизина для сшивающих реагентов. В результате эти типы белковых сборок могут быть несовместимы с мультимерным PAGE. Также возможно, что кумасси синий, который связывается с гидрофобными участками и катионными остатками, задерживается после уравновешивания в PBS и в некоторых случаях блокирует сшивание19.Это может уменьшить или исключить обнаружение затронутых олигомеров с помощью мультимер-PAGE. Таким образом, этот метод не является универсальным анализом для характеристики всех белковых ассоциаций, и его не следует рассматривать там, где требуется количественное определение. Однако мультимер-PAGE является недорогим и относительно быстрым инструментом для анализа белковых комплексов, и его можно рассматривать наряду с другими известными методами.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Поддерживается NIH / NIDA DA034783.Мы благодарим Брайана А. Киллинджера за техническую помощь с multimer-PAGE.

Список литературы

• Альбертс Б. Клетка как совокупность белковых машин: подготовка следующего поколения молекулярных биологов. Клетка. 1998. 92 (3): 291–294. [PubMed] [Google Scholar]
• Pawson T, Nash P. Белковые взаимодействия определяют специфичность передачи сигнала. Genes Dev. 2000. 14 (9): 1027–1047. [PubMed] [Google Scholar]
• Rual JF, et al. К карте протеомного масштаба сети белок-белкового взаимодействия человека.Природа. 2005. 437 (7062): 1173–1178. [PubMed] [Google Scholar]
• Phizicky EM, Филдс С. Белковые взаимодействия: методы обнаружения и анализа. Microbiol Rev.1995; 59 (1): 94–123. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ho Y, et al. Систематическая идентификация белковых комплексов в Saccharomyces cerevisiae с помощью масс-спектрометрии. Природа. 2002. 415 (6868): 180–183. [PubMed] [Google Scholar]
• Krogan NJ, et al. Глобальный ландшафт белковых комплексов дрожжей Saccharomyces cerevisiae.Природа. 2006. 440 (7084): 637–643. [PubMed] [Google Scholar]
• Wittig I, Braun HP, Schagger H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 2006; 1 (1): 418–428. [PubMed] [Google Scholar]
• Schagger H, Cramer WA, von Jagow G. Анализ молекулярных масс и олигомерных состояний белковых комплексов с помощью синего нативного электрофореза и выделение мембранных белковых комплексов с помощью двумерного нативного электрофореза. Анальная биохимия. 1994. 217 (2): 220–230. [PubMed] [Google Scholar]
• Laemmli UK.Расщепление структурных белков при сборке головки бактериофага Т4. Природа. 1970. 227 (5259): 680–685. [PubMed] [Google Scholar]
• Beisiegel U. Protein Blotting. Электрофорез. 1986; 7 (1): 1–18. [Google Scholar]
• Киллинджер Б.А., Мощинская А. Характеристика стехиометрии мультимера альфа-синуклеина в сложных биологических образцах с помощью электрофореза. Anal Chem. 2016. 88 (7): 4071–4084. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Newman AJ, Selkoe D, Dettmer U.Новый метод количественного иммуноблоттинга эндогенного альфа-синуклеина. PLoS One. 2013; 8 (11): e81314. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wong SS. Химия белковой конъюгации и сшивки. Бока-Ратон: CRC Press; 1991. [Google Scholar]
• Seddon AM, Curnow P, Booth PJ. Мембранные белки, липиды и детергенты: не только мыльная опера. Biochim Biophys Acta. 2004; 1666 (1-2): 105–117. [PubMed] [Google Scholar]
• Tanford C, Reynolds JA. Характеристика мембранных белков в растворах детергентов.Biochim Biophys Acta. 1976; 457 (2): 133–170. [PubMed] [Google Scholar]
• Петерс К., Ричардс FM. Химическая сшивка: реагенты и проблемы исследования структуры мембран. Анну Рев Биохим. 1977; 46: 523–551. [PubMed] [Google Scholar]
• Lomant AJ, Fairbanks G. Химические исследования расширенных биологических структур: синтез и свойства сшивающего реагента [35S] дитиобис (сукцинимидилпропионат) J Mol Biol. 1976; 104 (1): 243–261. [PubMed] [Google Scholar]
• Sun F, et al.Кристаллическая структура белкового комплекса митохондриальной респираторной мембраны II. Клетка. 2005. 121 (7): 1043–1057. [PubMed] [Google Scholar]
• Виттиг И., Шаггер Х. Нативные электрофоретические методы для определения белок-белковых взаимодействий. Протеомика. 2009. 9 (23): 5214–5223. [PubMed] [Google Scholar]

Модель изогнутого хвоста (Cd) дефектов нервной трубки человека, чувствительных к фолатам, мутирована в белок 6, связанный с рецептором липопротеина корецептора Wnt, 6

Аннотация

Дефект черепной нервной трубки у мышей с кривым хвостом ( Cd ) предотвращается пренатальным диетическим клонированием фолиевой кислоты Cd позиционное клонирование выявляет миссенс-мутацию высококонсервативной аминокислоты в белке 6, связанном с рецепторами липопротеинов низкой плотности ( Lrp6 ), корецептор, необходимый для канонической передачи сигналов Wnt.Молекулярное моделирование предсказывает, что Lrp6 ^Cd изменяет шарнирную область второго домена β-пропеллера YWTD. Мутантный LRP6 связывается с Wnt и Dickkopf1 (Dkk1), но не с Mesd1, и Dkk1 не может противодействовать Wnt в клетках Cd / Cd , что приводит к гиперактивности. Клетки NIH 3T3, трансфицированные мутантной плазмидой Lrp6, противостоят антагонизму Dkk1 так же, как клетки Cd / +, что подтверждает значимость мутации. Мутация Lrp6 у мышей Cd предоставляет доказательства функциональной связи между передачей сигналов Wnt и спасением фолатом дефектов нервной трубки.

N Дефекты евральной трубки (NTD), включая анэнцефалию и расщелину позвоночника, поражают 0,5–1 на 1000 живорождений во всем мире (1). Они могут возникать сами по себе или в сочетании с другими аномалиями, включая конечности, черепно-лицевые структуры, сердце или почки. Генетика вносит свой вклад в NTD, но ассоциации между вариантными генами и фенотипами NTD трудно установить из-за взаимодействия генов и неполной пенетрантности, что создает риск рецидива только 1 из 10 в семьях с двумя больными братьями и сестрами (2).Несмотря на эту генетическую сложность, в многочисленных клинических исследованиях было обнаружено, что витамин фолиевая кислота снижает риск NTD на 50-70% даже при отсутствии дефицита питания (3, 4). Многие исследования уровней и транспорта фолиевой кислоты не обнаружили прочной связи между NTD и метаболическим путем фолиевой кислоты, которая могла бы объяснить широкую пользу фолиевой кислоты. Понимание его действия потребует сравнения на молекулярном, клеточном и системном уровнях моделей животных, у которых NTD предотвращается с помощью фолиевой кислоты, и тех, которые устойчивы к этому витамину.

ДНТ у мышей с кривым хвостом ( Cd ) улучшается при приеме фолиевой кислоты в рационе, что очень похоже на клинические исследования, что делает его отличной моделью ДНТ, реагирующей на фолат, у людей (5). Гетерозиготные мыши Cd / + демонстрируют изогнутый хвост, тогда как животные Cd / Cd , получавшие 4 мг фолиевой кислоты / кг пренатальной диеты, обнаруживают фенотипы, которые включают раннюю постимплантационную летальность (20-30% гомозигот) и экзэнцефалию (20-30%). %). Cd / Cd Плоды, которые закрывают черепную нервную трубку, жизнеспособны, но имеют жизнеспособность (≈25% мышей Cd / Cd ), с более серьезными пороками развития различных хвостовых и поясничных позвонков по сравнению с Cd / + братья и сестры.

Здесь миссенс-мутация в Cd заменяет единственную высококонсервативную аминокислоту в белке, родственном рецептору липопротеинов низкой плотности (LDL), LRP6. LRP6 (стрелка в Drosophila ) представляет собой корецептор LDL для wingless (Wnt), и либо LRP6, либо LRP5 необходимы для передачи сигналов Wnt через путь frizzled (Fz) рецептор-β-катенин (6-8).Ранее было показано, что полная инактивация Lrp6 путем вставки гена вызывает экзэнцефалию, расщелину позвоночника, отсутствие хвоста и деформации конечностей (7), тогда как гипоморфная точечная мутация в Lrp6 вызывает остеопороз и расщелину позвоночника (9). Мутация Cd не инактивирует каноническую передачу сигналов Wnt, а вместо этого устраняет способность Dickkopf1 (Dkk1) ингибировать Wnt, создавая чистый гиперактивный аллель. NTD у мышей теперь ассоциирована с потерей Lrp6 (7), растрепанных 2 (Dvl2 ) и Dvl1 / 2 двойных нулей (10), Axin (11) и миссенс-мутаций. в Lrp6 вызывает гипо- или гиперактивность (исх.9 и этот отчет). Таким образом, генетические варианты в сигнальных путях Wnt могут приводить к NTD. Идентификация мутации Lrp6 в Crooked tail представляет собой указание на то, что гены пути Wnt могут участвовать в чувствительных к фолатам NTD.

Методы

Обслуживание колонии.
Cd / + скрещивали с мышами DBA / 2J (The Jackson Laboratory). Кривохвостое потомство F ₁ затем скрещивали с мышами A / J (Лаборатория Джексона) с получением потомства N ₂ .На 18 сутки постнатального развития детеныши N ₂ были фенотипированы по кривому хвосту. Эмбрионы и живое потомство были фенотипированы путем визуального осмотра, а в некоторых случаях препараты скелета были приготовлены с использованием стандартных процедур (12). Для исследований комплементации Lrp6
^+/- мышей скрестили с Cd
^+/- и Cd и Lrp6
Аллели ^— генотипировали, как описано (5, 7).

Генотипирование. Панель из 23 полиморфных маркеров (13) на дистальной хромосоме 6 (Research Genetics, Huntsville, AL) была использована для гаплотипирования 1043 кривохвостых мышей N ₂ с использованием условий ПЦР, как подробно описано в отчете первых 221 N _{. 2} животных (5). Один SNP, идентифицированный в экзоне 4 Rai3 , был использован для отличия Cd от DBA среди 14 образцов, показывающих рекомбинацию с Cd между D6Mit111 и D6Mit301.

Генетическая карта. Порядок генов и расстояния рекомбинации определяли по результатам генотипирования 1043 потомков N ₂ с использованием программы диспетчера карт (14).

Идентификация и секвенирование генов-кандидатов. В геноме мыши (Ensembl Genome Browser) был проведен поиск генов-кандидатов между маркерами D6Mit111 и D6Mit301. База данных генома мышей показала, что 18 известных или предсказанных генов находились в этом регионе (15, 16).Были сконструированы праймеры для секвенирования и ПЦР для всех 72 экзонов из 14 генов, и последовательности мышей Cd / Cd сравнивали с + / + и базой данных GenBank.

конструкций ДНК. кДНК LRP6 мыши (J. F. Hess, Merck Research Laboratories) была помечена myc-эпитопом на С-конце с использованием метода ПЦР. КДНК LRP6 (G494D) получали путем сайт-направленного мутагенеза (QuikChange, Stratagene). КДНК Dkk-1 мыши, полученная с помощью ОТ-ПЦР с эмбрионального дня (E) 10.5 мРНК мыши представляла собой эпитоп FLAG, помеченный на С-конце и вставленный в экспрессионную плазмиду pCNA3.1 (+). Дополнительные плазмиды включают в себя следующие: Mesd с меткой FLAG (BC Holdener, Государственный университет Нью-Йорка в Стоуни-Брук), Kremens2 с меткой FLAG (Krm2) (C. Nierhs, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg) и кДНК Wnt1 с меткой HA (Upstate Биотехнология, Лейк-Плэсид, штат Нью-Йорк).

Анализ Wnt в эмбриональных фибробластах мыши Cd (MEF) и трансфицированных клетках NIH 3T3. клеток MEF из потомства E13.5 от спаривания пар Cd / + × Cd / + получали, как описано (17). Ткань плода была использована для генотипирования Cd , что позже было подтверждено на культивируемых фибробластах. Каноническая передача сигналов Wnt была оценена in vitro с помощью анализа стабилизации β-катенина (18). Кондиционированные среды (CM) собирали из L-клеток мыши, секретирующих Wnt3a, и из контрольных L-клеток мыши (Американская коллекция типовых культур), как рекомендовано Американской коллекцией типовых культур.КДНК Dkk-1 трансфицировали в клетки Cos-1 с помощью липофектамина 2000 и собирали CM через 48 часов после трансфекции. Если не указано иное, все антитела были получены от Santa Cruz Biotechnology. Секрецию Dkk-1 в среду подтверждали иммунопреципитацией (IP)-Вестерн-блоттингом с антителом против FLAG (Sigma). КМ в указанном разведении наносили на клетки MEF или клетки NIH 3T3, трансфицированные pLrp6, и инкубировали в течение 2 часов перед лизисом белка и вестерн-блоттингом уровней цитозольного β-катенина (анти-β-катенин, лаборатория сигнальной трансдукции).Оптическую плотность полос измеряли (Quantity One, Bio-Rad) и нормализовали для мечения анти-внеклеточной сигнальной регулируемой киназой (ERK) того же блота. Wnt3a или контрольный CM разбавляли 1: 3 бессывороточной средой. Для анализа ингибирования Dkk-1 CM смешивали в соотношении: Wnt3a: бессывороточная среда: Dkk-1 = 1: 2: 1. Трансфицированные белки Lrp6 были биотинилированы на поверхности клетки, как описано, с использованием 0,5 мг / мл сульфо-HNS-биотина и обнаружены в myc-pull-down связыванием конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена (HRP) (Pierce) (19).

Результаты

Эксэнцефалия у мышей Cd свидетельствует о первичном дефекте закрытия среднего мозга (рис. 1 A
). Окрашивание нами скелета нескольких животных Cd / Cd соответствовало первоначальному описанию Cd 50 лет назад в том смысле, что не наблюдалось случаев явной или скрытой расщелины позвоночника (20). Cd был скрещен в 1980-х годах для поддержания жизнеспособности линии, а в 1990-х годах с 129 / SvJ, C57BL / 6J, CAST / Ei и DBA / 2J для изучения пенетрантности мутации (5), но расщелина позвоночника не была наблюдаемый.Таким образом, различия в генетических модификаторах не были ответственны за отсутствие спинномозговой NTD у гомозигот. Однако у мышей Cd / Cd , завершивших нейруляцию, были тяжелые пороки развития хвостовых позвонков, достигающие уровня грудной клетки (рис. 1 D и E ).
). Конечности и пальцы были нормально сформированы на всех исследованных фонах деформации (Рис.1 A — C
). Проиллюстрировано окрашиванием альциановым синим мыши E14 Cd / Cd на рис.1 E
искривленный хвост является результатом деформации сомитов / ранних позвонков, включая полупозвонки, деформированные или сросшиеся позвонки, а также более мелкие сомиты с уменьшенными межпозвоночными промежутками. Эти особенности типичны для «синдрома Вирбеля-Риппена» (WRS), группы классических мутантов мышей, к которым был отнесен штамм Crooked tail (21). О случаях полидактилии / синдактилии не сообщалось у> 2000 мышей, исследованных Морганом (20), или у> 3000 мышей Cd , фенотипированных в наших исследованиях.Возможна некоторая задержка вторичных участков окостенения пальцев (рис. 1 C
).

Рисунок 1.

Мыши Cd демонстрируют черепные, но не спинномозговые NTD. ( A ) Экзэнцефальный эмбрион E16 Cd / Cd имеет нормальные конечности и не усеченный хвост.( B ) Тот же эмбрион E16 после окрашивания скелета ализариновым красным (кость) и альциановым синим (хрящ) (правая передняя лапа показана на вставке ). Хвостовые позвонки не окрашены, так как кожная ткань не отслаивалась. ( C ) Передняя лапа от другого эмбриона E16 Cd / Cd и + / + родного брата. ( D ) E14 Cd / Cd экзэнцефальный эмбрион имеет изогнутый хвост с неправильными сомитами, включая полупозвонок (стрелка слева), деформированный сомит (правая стрелка со звездочкой), два небольших сомита (двойной наконечник стрелки) и деформированный сомит, образующий второй изгиб в хвосте (одиночная стрелка).Звездочки указывают эквивалентные сомиты в + / + и Cd / Cd братьев и сестер. ( E ) Скелетные дефекты у взрослого мужчины Cd / Cd , которые закрыли нервную трубку. Разрозненные хвостовой копчиковый (C) и поясничный (L) позвонки деформированы.

Для анализа сцепления Cd / + гетерозиготы были скрещены с DBA / 2J с получением поколения F ₁ , и 73 кривохвостых потомства F ₁ были скрещены с мышами A / J (исходный фон — Cd ). для получения потомства обратного скрещивания N ₂ .Поскольку фенотип не полностью пенетрантный, только пораженные мыши наверняка несут мутацию Cd . Следовательно, мыши F ₁ и N ₂ с нормальным хвостом были исключены из анализа. Критический интервал 0,2 сМ для Cd был дополнительно уточнен с использованием 24 полиморфных маркеров на дистальной хромосоме 6 (5). Среди 1043 потомков N ₂ , 2 рекомбинанта возникли между Cd и D6Mit111, 2 рекомбинанта возникли между Cd и Rai3 и 10 рекомбинантов возникли между Cd и D6Mit301 (рис.2 А
и Таблица 1, которая опубликована в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS).

Рис. 2.

Генетические и физические карты локуса Cd . ( A ) Полиморфные маркеры между DBA / 2J и Cd показаны с точкой разрыва между D6Mit111 и Rai3 (каждый оценивается в 0.2 ± 0,14 см из Cd ). Все 24 маркера от D6Mit132 до D6Mit294 имели значимые баллы LOD (логарифм отношения правдоподобия) с наивысшим баллом 299,6 и самым низким 118,1 (таблица 1). ( B ) Физическая карта критической области генома Cd показывает относительные положения маркеров и генов, которые были секвенированы у мышей Cd . ( C — E ) Потомство от Cd / + × Lrp6
Мыши ^+/- обнаруживают полный диапазон фенотипов Cd / Cd .В C пять двойных гетерозиготных Cd / Lrp6
^— детенышей по бокам + / + братьев и сестер, и у них слегка (черная стрелка) или сильно (стрелки) кривые хвосты. У одного щенка неровный позвоночник (белая стрелка), окраска скелета ( D ) показывает сросшиеся позвонки (стрелка) и полупозвонок (белая стрелка). А Cd / Lrp6
Эмбрион ^— демонстрирует экзэнцефалию ( E ), которая, как и дефекты поясничных позвонков, наблюдалась только у мышей Cd / Cd .г, спинной; v, вентрально. Аббревиатуры генов см. В таблице 2.

Физическая карта области генома Cd показана на рис. 2 B
на основе базы данных геномов мышей (15, 16). Анализ последовательности не обнаружил различий между Cd / Cd и + / + в восьми из девяти кандидатов в критической области между D6Mit111 и Rai3 (рис. 2 B ).
и Таблица 2, которая опубликована в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS).Данные о связывании с высоким разрешением поместили Cd в нерекомбинантную область размером 1 Mb в положение, близкое к Lrp6 (обозначено 95% доверительными интервалами в таблице 1). Поддерживая Lrp6 в качестве кандидата на Cd , генная ловушка с полной нулевой мутацией Lrp6 продуцирует как спинномозговую, так и краниальную NTD, а также дефекты конечностей и усечение хвоста (7). Двойное гетерозиготное потомство от Cd / +, скрещенное с Lrp6
Мыши ^+/- показали полный спектр фенотипов Cd / Cd (рис.2 С — E
), включая эмбриональную летальность, что указывает на то, что Cd и Lrp6
^— — аллели одного и того же гена. Из 23 экзонов Lrp6 однонуклеотидная замена была обнаружена в экзоне 7 (рис. 3), но не в + / + братьях и сестрах или дополнительных девяти штаммах (C57BL / 6J, A / He / J, A / J, 129P3 / J, BALB / cByJ, CBA / CaJ, DBA / 2J, SPRET / Ei и CAST / Ei), включая A / J, прямой потомок штамма, в котором произошел Cd .Мутация заменяет высококонсервативный глицин аспартатом (G494D) во втором повторяющемся домене YWTD-EGF (рис. 3).

Рис 3.

Анализ последовательности ДНК гена Lrp6 в Cd . ( A ) Все 23 экзона в Lrp6 были секвенированы у мышей Cd / Cd .По сравнению с братьями и сестрами + / +, базой данных мышей и 9 дополнительными линиями мышей, Cd отличался только экзоном 7 с заменой G1567A, которая предсказывает замену глицина на аспартат аминокислоты 494. ( B ) Мотивы белка LRP6 и расположение изменения G494D во втором YWTD-EGF-подобном повторе (последовательность, подробно описанная на фиг. 7). ( C ) Сравнение видов во втором повторе YWTD LRP6. Мутантный остаток глицина (красный прямоугольник) высоко консервативен. Указаны 3-6 повторов YWTD.Зеленый, идентичный на 4/4; желтый, 3/4; синий, уникальный или 2/4.

Вычислительное моделирование LRP6 ^Cd основано на кристаллической структуре рецептора LDL (LDLR), в которой каждый повторяющийся домен YWTD-EGF образует шестилопастную структуру β-пропеллера, которая обеспечивает межбелковые взаимодействия (22) (рис. . 4 А
). Сравнение LRP6 ^Cd с LDLR указывает на решение для уплотнения лопастей (рис. 4 B
и рис.7, который опубликован в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). Мутация G494D находится в шарнирной области лопасти 4 второго пропеллера, которая объединяет консервативный мотив «PXG», в котором пролин (рис. 4 A
) инициирует β-изгиб, тогда как положение «X» представляет собой аспарагин или другой остаток с боковой цепью большого объема. Шесть остатков от каждого лезвия плотно упаковываются у ворот центральной оси или «канала». Остаток глицина или аланина в PXG (рис.7) фиксирует положение остатка X, и замена в этом положении нарушит упаковку X в воротах. Сравнение вычисленных поверхностных электростатических потенциалов для второго пропеллера LRP6 ^WT с LRP6 ^Cd предполагает, что мутация изменяет свойства канала в мотиве таким образом, который, вероятно, повлияет на взаимодействия в сигнальном механизме (рис. 4 ). C и D
).

Инжир.4.

Молекулярное моделирование белка LRP6 ^Cd . ( A ) Остатки с заполненным пространством в положении X мотивов PXG показаны в кристаллической структуре домена LDLR YWTD-EGF (код 1IJQ банка данных белка). Белые палочки — это N-концевые пролины. Остатки X плотно упаковываются, чтобы покрыть ворота центрального канала, образованного шестью повторами YWTD. ( B ) Второй домен YWTD-EGF в мышиных LRP6 ^WT и LRP6 ^Cd на основе A (выравнивание последовательностей на рис.7). E, домен EGF; W1-W6, крыло или лопасть винта. ( C ) На виде сверху (тот же угол обзора, что и у B ) показаны поверхности с электростатическим потенциалом (ЭП) LRP6 ^WT и LRP6 ^Cd . Вклады остатков X в мотивы PXG были удалены, чтобы выявить изменения в поверхностных E.P. в центральном канале предсказана мутация Cd . ( D ) Вид сбоку в разрезе E.P. поверхности, образующие канал. Области отрицательных поверхностных ЭП окрашены в красный цвет (<-15 кТл), а области положительного потенциала (> 15 кТл) — в синий цвет.Гомологическое моделирование выполнялось с помощью моделлера 4 (35). Панели A, и B были приготовлены с использованием мольмоля (36). ЭП и молекулярная поверхность рассчитывались с помощью хватки (37). Поверхности, представленные в C и D , были подготовлены в swiss-pdbviewer 3.7 (38).

Члены семейства LDLR, LRP5 и LRP6, являются корецепторами для Fz и необходимы для Wnt-зависимой передачи сигналов β-catenin (23). Каноническая сигнализация Wnt (рис.5 А
) поэтому исследовали на клетках Cd, /, Cd и WT MEF, оценивая количество цитозольного β-катенина, обнаруженного при Вестерн-блоттинге. В присутствии Wnt3a уровни β-катенина увеличивались в 6-10 раз в клетках MEF + / +, Cd / + и Cd / Cd (рис. 5 B и C ).
), указывая на то, что Wnt может передавать сигналы через LRP6-Fz в ячейках Cd . Несколько важных модуляторов Wnt взаимодействуют с LRP6, включая его антагонист Dkk1 (24).В этих культурах Dkk1 эффективно ингибировал активность Wnt в + / + MEF (WT, снижено на 70%), но не мог блокировать передачу сигналов Wnt в клетках MEF Cd / Cd , тогда как MEF Cd / + демонстрировали промежуточный ответ на Dkk1 (рис. 5 C
). Трансфекция плазмид + / + и Lrp6-G494D в клетки NIH 3T3 проверяла, будет ли точечная мутация также нарушать Dkk1 на генетическом фоне WT, вдали от штамма Cd (рис. 5 D и E ).
).Действительно, культуры, трансфицированные pLrp6 ^Cd -myc, показали нарушение ингибирования Wnt с помощью Dkk1, подобное уровням, наблюдаемым в MEF Cd / +. Мы пришли к выводу, что в присутствии мутантного LRP6 ^Cd антагонист Wnt, Dkk1, не регулирует должным образом каноническую передачу сигналов Wnt.

Рис. 5.

Lrp6 ^Cd и каноническая сигнализация Wnt.( A ) Мультибелковый комплекс способствует опосредованному гликогенсинтазой киназе 3β (GSK3β) фосфорилированию β-катенина для разрушения комплексом убиквитин-лигазы Е3. Wnt передает сигнал через LRP6-Frizzled, чтобы активировать растрепанный (Dvl), который связывает аксин, чтобы ингибировать фосфорилирование β-катенина GSK3β, ингибируя убиквитинирование и увеличивая уровни β-катенина, который затем перемещается, чтобы активировать TCF / LEF [фактор транскрипции (Т-клеточно-специфический ) / лимфоидный энхансер-связывающий фактор 1] факторы транскрипции семейства.Перенос Lrp6 внутрь и из мембраны облегчается шаперонным действием Mesd. ( B ) Передача сигналов Wnt через β-катенин в MEF, происходящих от + / +, Cd / + и Cd / братьев и сестер Cd на E13. Уровни цитозольного β-катенина нормализованы по отношению к общей киназе, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK), с помощью вестерн-блоттинга. Хотя Wnt3a CM стимулирует каноническую передачу сигналов, Dkk1 не может противодействовать стимуляции Wnt3a в клетках Cd / Cd , тогда как MEF Cd / + демонстрируют промежуточный ответ.C — контроль; W, Wnt3a; D, Dkk1. ( C ) Денситометрия трех отдельных экспериментов. Уровни стимулированного β-катенина в клетках MEF, обработанных Wnt3a, нормализовали до 100% и сравнивали с клетками, обработанными Wnt3a плюс Dkk1 CM. ( D ) Анализ цитозольного β-катенина в клетках NIH 3T3 после трансфекции плазмидами, экспрессирующими myc-tagged WT Lrp6 (pLrp6-myc) или мутант G494D (pLrp6 ^Cd ). ( E ) Количественная оценка трех экспериментов показывает, что передача сигналов Wnt в клетках, трансфицированных pLrp6-myc, снижена на 80% экзогенным Dkk1, тогда как клетки, трансфицированные pLrp6 ^Cd , уменьшены только на 55%, аналогично гетерозиготным Cd / + MEF.( F ) Хвостовые сомиты братьев и сестер E9.5, окрашенные антителом к ​​β-катенину (разведение 1: 100 000; парафиновые срезы размером 6 мкм; увеличение × 60), показывают больше цитозольного β-катенина (открытая стрелка) / ядра (закрашенные стрелки) Мечение эмбриона Cd / Cd соответствует гиперактивности Wnt in vivo.

^* , P <0,01.

Затем мы исследовали E9.5 эмбрионов для доказательства гиперактивности Wnt в каудальных сомитах экзэнцефальных эмбрионов Cd / Cd по сравнению с братьями и сестрами WT с использованием серийных разведений иммуноокрашивания против β-катенина (рис. 5 F
и рис. 8, который опубликован в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). Генотипы были подтверждены с использованием ДНК из эмбриональных желточных мешков. Большее накопление ядерного β-катенина было обнаружено в клетках каудальных сомитов Cd / Cd по сравнению с + / + эмбрионами.Эти данные подтверждают более высокие уровни передачи сигналов Wnt у эмбрионов Cd / Cd во время нейруляции.

Эпитоп, меченный Lrp6, Wnt1, Dkk1, Mesd или Krm2, трансфицировали в клетки COS для тестирования взаимодействий. Wnt1 все еще был способен связываться с LRP6 ^Cd в анализе коиммунопреципитации (co-IP), независимо от того, удаляет ли Lrp6 или Wnt1, меченный эпитопом (фиг. 6 A ).
). Несмотря на потерю антагонизма, Dkk1 связывался с Lrp6 ^Cd (рис.6 В
) и Krm2, трансмембранный белок, который может усиливать ингибирование Dkk1, совместно IP’d с Lrp6 ^Cd (рис. 9, который опубликован в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). Mesd взаимодействует с Lrp5 / 6 как шаперонный белок, который облегчает транспортировку Lrp6 в клеточную мембрану и из нее (25) и, как сообщается, связывается с первым доменом YWTD Lrp5. Мутантный белок Lrp6 ^Cd не ко-IP с Mesd, будь то направленный вниз Lrp6 (myc) или Mesd (FLAG) (рис.6 С
). Трансфицированный myc-Lrp6 ^Cd тем не менее вставлен в плазматическую мембрану, хотя и менее эффективно (фиг. 6 D
).

Рис. 6.

Lrp6 ^Cd сохраняет Wnt и Dkk1, но удаляет привязку Mesd.Показаны клетки COS, трансфицированные pLrp6-myc или pLrp6 ^Cd -myc и одним из следующих: pDkk1-FLAG (D), pWnt1-HA (W) или Mesd-FLAG (M). Нетрансфицированные (-Tx) культуры были контрольными. ( A ) Лизаты подвергали IP-обработке с помощью анти-myc или анти-HA и анализировали на Вестерн-блоттинге, разработанном с использованием антител против Lrp6 или против HA. ( B ) Лизаты IP’d с антителами myc или FLAG, разрушающими как Lrp6, так и Dkk1. ( C ) Лизаты IP’d с антителами myc или FLAG разрушили WT Lrp6 и Mesd, но не совместно IP Lrp6 ^Cd и Mesd.( D ) Клетки, трансфицированные меченными myc Lrp6 ^wt или Lrp6 ^Cd , биотинилировали на их поверхности. Клеточные лизаты подвергали IP-атаке с помощью анти-myc, и вестерн-блоттинг проявляли либо с пероксидазой хрена, конъюгированной со стрептавидином (SA), либо с анти-Lrp6. Присутствовали эквивалентные количества белков myc-Lrp6, тогда как меньшие количества myc-Lrp6 ^Cd были вставлены в плазматическую мембрану.

Обсуждение

Мутация Cd, G494D явно изменяет функцию Lrp6.Во-первых, он заменяет высококонсервативный остаток G на D, обнаруженный в Cd / Cd , а не в + / + братьях и сестрах или девяти других линиях мышей. Во-вторых, молекулярное моделирование Lrp6 G494D предсказывает значительное изменение его структурных свойств. В-третьих, мутация Lrp6, ^Cd, , , как показано, препятствует антагонизму Dkk1 передачи сигналов Wnt в MEF, полученных из Cd / Cd , и в клетках 3T3, трансфицированных pLrp6 ^Cd . То, что Lrp6 ^Cd приводит к гиперактивности Wnt, подтверждается повышенным уровнем β-catenin в каудальных сомитах E9.5 Cd / Cd эмбрионов по сравнению с + / + братьями и сестрами. Причинная связь между дефектами Lrp6 ^Cd и Cd подтверждается тем фактом, что Lrp6G494D является единственной мутацией, обнаруженной среди кодирующих последовательностей 14 генов в области Cd . Более того, осевые дефекты скелета в другой гипоморфной мутации Lrp6R886W в ringelschwanz ( rs ) были независимо отнесены к той же фенотипической группе мутантов Wirbel-Rippen-Syndrom, что и Cd (9).Интересно, что в то время как Lrp6 full-null отображает либо расщепление позвоночника, либо экзэнцефалию, rs / rs отображает расщепление позвоночника, а Cd / Cd отображает исключительно экзэнцефалию. Наконец, Cd / Lrp6
^— двойные гетерозиготные мыши демонстрируют полный фенотипический диапазон Cd / Cd , так что нулевой аллель Lrp6 демаскирует эффекты Cd , обеспечивая генетическое подтверждение того, что Cd является мутацией Lrp6.

То, что G494D в Lrp6 ^Cd изменяет свою способность регулироваться, поскольку корецептор Fz подтверждается сравнением с кристаллической структурой LDLR и по аналогии с патогенными мутациями у людей с участием близкородственного корецептора Wnt, LRP5 ( 22, 26-29). В LRP5 миссенс-мутации в β-пропеллерах 2 или 3 связаны с нарушением низкой плотности костей, называемым псевдоглиомой остеопороза (OPPG) (26). При другом заболевании, высокая костная масса (HBM), мутация LRP5 возникает на поверхности первого пропеллерного модуля, препятствуя антагонизму DKK1 передачи сигналов WNT (27, 28).Таким образом, можно предположить, что миссенс-мутация в LRP6 будет иметь общее активирующее или ингибирующее воздействие, в зависимости от его положения в структуре YWTD-EGFP, β-пропеллера. Поверхностный электростатический заряд центрального канала внутри второго β-пропеллера, по-видимому, изменяется из-за нарушенной локальной упаковки X-остатков, которые обнажены на поверхности канала. Экспериментальные результаты подтверждают, что это изменение нарушает способность LRP6 регулировать передачу сигналов Wnt в присутствии Dkk1.

Обе мутации Lrp5 G171V и Lrp6 ^Cd вызывают эффекты усиления функции, но ни одна из них существенно не изменяет связывание Wnt или Dkk1, тогда как обе мутации отменяют связывание Mesd (19). Тогда кажется, что первый и второй β-пропеллерные домены Lrp5 / 6 необходимы для антагонизма Dkk1 и взаимодействия Mesd. Поскольку Krm2 co-IP’d с комплексами Lrp6 ^Cd , неспособность Dkk1 ингибировать передачу сигналов Wnt не объясняется потерей взаимодействия Krm2. Молекулярное моделирование подчеркивает важность ядра β-пропеллера для регуляции функции Lrp5 / 6.В самом деле, изменения, которые сильно мешают антагонизму Dkk1 в исследованиях мутагенеза Lrp5 (E721A и R764A) (19), локализуются в мотиве PXG, идентифицированном здесь (рис. 4), и вызывают серьезные изменения в электростатических свойствах ядра.

Модель действия Mesd с Lrp5, которая отличает внутриклеточную «аутокринную» передачу сигналов Wnt от секретируемой «паракринной» передачи сигналов Wnt, была предложена (19) на основании данных котрансфекции. Базальная паракринная передача сигналов Wnt через Lrp5G171V, как полагают, нарушается из-за снижения трафика рецепторов в отсутствие связывания Mesd, тогда как аутокринная передача сигналов Wnt остается неизменной.Наши эксперименты с MEFs не поддерживают эту модель, потому что базальные ответы на внеклеточный Wnt3a были неотличимы между генотипами + / + и Cd / Cd . Более того, отсутствие взаимодействия с Mesd не отменяет способность Lrp6 ^Cd проникать через мембрану. Кроме того, клетки 3T3, трансфицированные pLrp6 ^Cd , проявляли стимуляцию внеклеточным Wnt, которая была эквивалентна pLrp6, но нарушала ответы на экзогенно применяемый Dkk1, демонстрируя влияние этой мутации на «паракринное» действие Wnt и Dkk1.Настоящие данные указывают на более сложную взаимосвязь между Lrp5 / 6 и Mesd, чем просто перенос белков, что требует дальнейшего изучения.

Lrp6 — четвертый ген Wnt, наиболее непосредственно связанный с каноническим путем, который, как было показано, способен продуцировать NTD у мышей, присоединяясь к Dvl1, Dvl2 и Axin (10, 11). Потеря Dvl2 вызывает расщелину грудной клетки и дефекты сердечного оттока, тогда как двойные мутанты Dvl 1 / 2 демонстрируют краниорахишизис (открытая нервная трубка от головы до поясницы) (10).Аксин (мутировавший в Fused NTD мыши) противостоит Dvl, и оба могут функционировать в канонических (β-catenin) и неканонических сигнальных путях планарной полярности клеток (PCP) (11, 30-33). Полная потеря Lrp6 вызывает тяжелые ростральные / каудальные NTD, дефекты конечностей и усечение хвоста (7), тогда как гипоморфный аллель вызывает остеопороз, каудальные аксиальные дефекты скелета, расщепление позвоночника и «случайную» полисиндактилию (9). Напротив, миссенс-мутация Lrp6, ^{, Cd,} , , описанная здесь, вызывает функциональную сверхэкспрессию (гиперактивность) и ассоциированную черепную NTD в дополнение к дефектам каудальных позвонков.Эти сходящиеся наблюдения вовлекают пути Wnt в NTD и подтверждают, что как положительная, так и отрицательная регуляция передачи сигналов Wnt важна для нейруляции.

Интересно, что Lrp5 / 6 наиболее тесно связаны с каноническими путями Wnt, хотя недавно было привлечено внимание к механизмам PCP в нейруляции (34). Три мутации Lrp6-null (7), гипоморфный (9) и гиперморфный (настоящий отчет) теперь связаны с NTD. Эти мутации указывают на то, что как Wnt-ассоциированные PCP, так и канонические пути вносят вклад в нейруляцию.Альтернативно, мнение, что Lrp5 / 6 участвуют исключительно в канонических путях, может быть пересмотрено. Более того, мутация Lrp6, ^{, Cd,} , предполагает, что даже незначительное изменение в последовательности LRP6 может привести к значительным врожденным дефектам, которые устраняются фолатом, несмотря на то, что сам пораженный ген не является прямым участником транспорта или метаболизма фолиевой кислоты. .

Благодарности

Мы благодарим докторов наук.Б. С. Холденеру, Дж. Ф. Хессу и К. Нирсу за их щедрые дары pMesd, кДНК Lrp6 и pKrm2; Доктору Энтони Брауну за полезное обсуждение анализа Wnt; и Том Ядекола за фотографию. Эта работа была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта, грант RO1 NS24998 (M.E.R.).

Сноски

• ↵
  ** Кому следует обращаться в лабораторию нейрогенетики и развития, Медицинский колледж Вейля Корнельского университета, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк 10021.Электронная почта: mer2005 {at} med.cornell.edu.

• ↵
  † M.C. и X.C. внес равный вклад в эту работу.

• ↵
  § Нынешний адрес: Департамент лабораторной медицины и патологии, Медицинская школа Университета Миннесоты, Миннеаполис, MN 55455.

• Авторские работы: М.К., Х.У. и М.Е.Р. спланированное исследование; M.C., X.C., B.S., S.M. и S.G. проводили исследования; M.C., X.C., B.S., S.M., S.G., L.S., F.C. и M.E.R. проанализированные данные; X.C., B.S., S.M., L.S. и F.C. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; и M.C., X.C., L.S., H.W. и M.E.R. написал газету.

• Этот документ был отправлен напрямую (Трек II) в офис PNAS.

• Сокращения: NTD, дефект нервной трубки; Cd , Кривой хвост ; ЛПНП, липопротеины низкой плотности; LDLR, рецептор LDL; LRP6, белок 6, связанный с рецептором липопротеинов; Fz , завитые ; MEF — эмбриональные фибробласты мыши; Dkk1, Dickkopf1; ко-IP, коиммунопреципитация; CM — кондиционированная среда; E n , эмбриональный день n .

• Copyright © 2005, Национальная академия наук

Удалить мини-гель Q-PAGE ™

Откройте кассету сразу после электрофореза.Избегайте высыхания геля.

1.
Вставьте устройство для открывания кассеты в углы кассеты.

2.
Последовательно подденьте открывалку, чтобы разделить две пластины.

3.
Осторожно потяните две пластины на верхнюю часть кассеты .

4.
Осторожно отделите гель от нижней или верхней стороны кассеты.

—
Избегайте диагонального отслаивания геля от угла.

— При необходимости используйте воду и средство для удаления геля, чтобы облегчить отслоение геля.

5. Осторожно удалите гель для дальнейшего окрашивания или вестерн-блоттинга.

Удаление геля Q-PAGE ™ Midi Gel

Откройте кассету сразу после электрофореза.Избегайте высыхания геля.

1. Вставьте устройство для открывания кассеты в углы кассеты.

2. Последовательно подденьте открывалку, чтобы разделить две пластины.

3. Осторожно отодвиньте две пластины от верхней части кассеты.

4. Используйте открыватель кассеты, чтобы протолкнуть прорезь в кассете.

5. Осторожно отделите гель от нижней части геля.

— Избегайте диагонального отслаивания геля от угла.

— При необходимости используйте воду и средство для снятия отслоения геля.

6. Осторожно удалите гель для дальнейшего окрашивания или вестерн-блоттинга.

Серповидноклеточная болезнь | Серповидноклеточная анемия

Что такое серповидноклеточная анемия (ВСС)?

Серповидно-клеточная анемия (SCD) — это группа наследственных нарушений эритроцитов.Если у вас SCD, проблема с гемоглобином. Гемоглобин — это белок красных кровяных телец, переносящий кислород по всему телу. При SCD гемоглобин превращается в жесткие стержни внутри красных кровяных телец. Это меняет форму красных кровяных телец. Предполагается, что клетки имеют форму диска, но при этом они приобретают форму серпа или серпа.

Серповидные клетки негибкие и не могут легко изменить форму. Многие из них разрываются при движении по кровеносным сосудам.Серповидные клетки обычно живут от 10 до 20 дней вместо обычных 90-120 дней. У вашего тела могут возникнуть проблемы с производством достаточного количества новых клеток, чтобы заменить те, которые вы потеряли. Из-за этого у вас может не хватить эритроцитов. Это состояние, называемое анемией, может вызывать у вас усталость.

Серповидные клетки также могут прилипать к стенкам сосудов, вызывая закупорку, которая замедляет или останавливает кровоток. Когда это происходит, кислород не может достичь близлежащих тканей. Недостаток кислорода может вызвать приступы внезапной сильной боли, называемые болевыми кризами.Эти атаки могут происходить без предупреждения. Если вы его получите, вам, возможно, придется обратиться в больницу для лечения.

Что вызывает серповидно-клеточную анемию (ВСС)?

Причина SCD — дефектный ген, называемый геном серповидных клеток. Люди с этим заболеванием рождаются с двумя генами серповидных клеток, по одному от каждого родителя.

Если вы родились с одним геном серповидно-клеточной анемии, это называется серповидно-клеточной особенностью. Люди с серповидноклеточной анемией обычно здоровы, но они могут передать дефектный ген своим детям.

Кто подвержен риску серповидно-клеточной анемии (ВСС)?

В США большинство людей с ВСС — афроамериканцы:

• Примерно 1 из 13 детей афроамериканцев рождается с серповидно-клеточным признаком
• Около 1 из каждых 365 чернокожих детей рождается с серповидно-клеточной анемией

SCD также поражает некоторых выходцев из Латинской Америки, Южной Европы, Ближнего Востока или азиатских индейцев.

Каковы симптомы серповидно-клеточной анемии (ВСС)?

Люди с ВСС начинают проявлять признаки болезни в течение первого года жизни, обычно в возрасте около 5 месяцев.Ранние симптомы ВСС могут включать

• Болезненный отек кистей и стоп
• Усталость или беспокойство от анемии
• Желтоватый цвет кожи (желтуха) или белков глаз (желтуха)

Эффекты SCD варьируются от человека к человеку и могут меняться со временем. Большинство признаков и симптомов ВСС связаны с осложнениями заболевания. Они могут включать сильную боль, анемию, повреждение органов и инфекции.

Как диагностируется серповидно-клеточная анемия (ВСС)?

Анализ крови может показать, есть ли у вас ВСС или серповидно-клеточные признаки.Все штаты теперь тестируют новорожденных в рамках своих программ скрининга, поэтому лечение можно начинать раньше.

Люди, которые думают о том, чтобы иметь детей, могут пройти тест, чтобы узнать, насколько велика вероятность того, что их дети будут иметь ВСС.

Врачи также могут диагностировать ВСС еще до рождения ребенка. В этом тесте используется образец околоплодных вод (жидкость в мешочке, окружающей ребенка) или ткани, взятой из плаценты (органа, доставляющего кислород и питательные вещества ребенку).

Какие методы лечения серповидно-клеточной анемии (SCD)?

Единственное лекарство от ВСС — трансплантация костного мозга или стволовых клеток.Поскольку эти трансплантаты опасны и могут иметь серьезные побочные эффекты, они обычно используются только у детей с тяжелой ВСС. Чтобы трансплантат работал, костный мозг должен быть похожим. Обычно лучший донор — это брат или сестра.

Существуют методы лечения, которые могут помочь облегчить симптомы, уменьшить осложнения и продлить жизнь:

• Антибиотики для профилактики инфекций у детей младшего возраста
• Обезболивающие при острой или хронической боли
• Гидроксимочевина, лекарство, которое снижает или предотвращает несколько осложнений ВСС.Увеличивает количество гемоглобина плода в крови. Это лекарство подходит не всем; поговорите со своим врачом о том, следует ли вам его принимать. Это лекарство небезопасно во время беременности.
• Детские прививки для профилактики инфекций
• Переливания крови при тяжелой анемии. Если у вас были серьезные осложнения, например, инсульт, вам могут сделать переливание, чтобы предотвратить новые осложнения.

Существуют и другие методы лечения конкретных осложнений.

Чтобы оставаться максимально здоровым, регулярно получайте медицинскую помощь, ведите здоровый образ жизни и избегайте ситуаций, которые могут вызвать приступ боли.

NIH: Национальный институт сердца, легких и крови

Выбор балансировки мутации со сдвигом рамки в гене MRC2 объясняет вспышку синдрома кривого хвоста у бельгийского голубого крупного рогатого скота

Abstract

В данном документе мы описываем позиционную идентификацию делеции 2 п.н. в открытой рамке считывания рецептора MRC2 , вызывающей рецессивный синдром кривого хвоста у крупного рогатого скота.Результирующий сдвиг рамки считывания выявляет преждевременный стоп-кодон, который вызывает бессмысленный распад мутантной информационной РНК и фактическое отсутствие функционального белка Endo180 у пораженных животных. Случаи демонстрируют аномалии скелета, которые, как считается, являются результатом нарушения ремоделирования внеклеточного матрикса во время окостенения, и пока еще необъяснимых мышечных симптомов. Мы демонстрируем, что статус носителя в значительной степени связан с желаемыми характеристиками в общей популяции, включая усиленное мышечное развитие, и что полученное преимущество гетерозигот вызвало выборочную развертку, которая объясняет неожиданно высокую частоту (25%) носителей в породе бельгийского голубого крупного рогатого скота. .

Сведения об авторе

Домашний скот подвергается интенсивному искусственному отбору, направленному на постоянно увеличивающиеся, иногда экстремальные производственные фенотипы. Это хорошо иллюстрируется исключительной мышечной гипертрофией, характерной для бельгийской голубой породы крупного рогатого скота с двумя мышцами (BBCB). В настоящем документе мы идентифицируем мутацию потери функции бычьего гена MRC2 , которая увеличивает мышечную массу у гетерозигот, но вызывает скелетные и мышечные пороки развития, известные как синдром кривого хвоста (CTS) у гомозигот.В результате «преимущества гетерозигот» мутация MRC2 c.2904_2905delAG охватила популяцию BBCB, что привело к появлению 25% животных-носителей и внезапному всплеску случаев CTS. Эти данные подчеркивают один из рисков, связанных с доведением домашних животных до их физиологических пределов с помощью интенсивного искусственного отбора.

Образец цитирования: Fasquelle C, Sartelet A, Li W, Dive M, Tamma N, Michaux C и др. (2009) Балансирование выбора мутации со сдвигом рамки в гене MRC2 объясняет вспышку синдрома кривого хвоста у бельгийского голубого крупного рогатого скота.PLoS Genet 5 (9):
e1000666.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000666

Редактор: Грегори С. Барш, Медицинский факультет Стэнфордского университета, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 19 мая 2009 г .; Принята к печати: 27 августа 2009 г .; Опубликовано: 25 сентября 2009 г.

Авторские права: © 2009 Fasquelle et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа финансировалась за счет грантов Министерства сельского хозяйства Валлонии (Rilouke), Бельгийской организации по научной политике (SSTC Genefunc PAI), Университета Льежа и Центра исследований рака молочной железы. CC является Chercheur Qualifié из Национального фонда научных исследований. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Бельгийская голубая порода крупного рогатого скота (BBCB) известна своим исключительным мышечным развитием, известным как «двойная мускулатура». Этот экстремальный фенотип частично обусловлен делецией с потерей функции 11 п.н. в гене миостатина, который был зафиксирован в породе (например, [1]), а также продолжающимся отбором еще не идентифицированных полигенов, влияющих на мускулистость. . Как и в случае с другими породами, интенсивный отбор существенно сократил эффективный размер популяции. Широкое использование искусственного оплодотворения (ИИ), в частности, позволяя популярным производителям иметь тысячи потомков, сужает генетическую основу.Сопутствующее увеличение скорости инбридинга вызывает повторяющиеся вспышки рецессивных дефектов. Унаследованные дефекты, которые недавно поразили BBCB, включают недавно описанные врожденные мышечные дистонии (CMD) I и II [2].

В результате такой специфической демографии популяций домашних животных наследственные дефекты обычно связаны с уникальными мутациями «основателя». Однородность аллелей значительно облегчает позиционную идентификацию с использованием сопоставления идентичности по происхождению (IBD), как недавно было продемонстрировано с использованием массивов SNP с высокой плотностью первого поколения для крупного рогатого скота [2].Гены, лежащие в основе CMD I и II, были легко картированы, и были идентифицированы причинные мутации в генах ATP2A1 и SLC6A5 . Широкое использование полученных диагностических тестов позволило незамедлительно и эффективно контролировать соответствующие патологии.

В данном документе мы сообщаем о позиционной идентификации мутации, вызывающей новый, недавно появившийся дефект, называемый синдромом кривого хвоста (CTS). Заболеваемость CTS резко возросла в BBCB, и теперь 25% животных являются носителями CTS.В данном документе мы приводим убедительные доказательства обострения мышечного развития носителей мутации CTS, что дает «преимущество гетерозигот», лежащее в основе избирательного охвата, которое подняло причинную мутацию до угрожающих размеров.

Результаты

Синдром кривого хвоста (CTS) проявляет переменную экспрессивность

Недавно мы создали платформу для наблюдения за наследственностью, работающую в тесном сотрудничестве с полевыми ветеринарами для быстрого выявления возникающих генетических дефектов.В рамках этих мероприятий в период с ноября 2006 года по ноябрь 2007 года платформе было сообщено о 105 случаях CTS. Помимо поразительного отклонения хвоста (с равной вероятностью правовращающего или левовращательного), подробное клиническое обследование выявило три общих симптома. во всех случаях: (i) общая задержка роста, проявляющаяся примерно в возрасте одного месяца, (ii) аномальная форма черепа, проявляющаяся в виде укороченной широкой головы, и (iii) крайняя мышечная гипертрофия, включая заметный рост якоря средней ягодичной мышцы.Дополнительные симптомы наблюдались в значительной части, но не во всех случаях: (i) спастический парез задних конечностей, затрагивающий либо только четырехглавую мышцу (22%), либо четырехглавую мышцу и икроножную мышцу (14%), часто связанный с прямыми скакательными суставами, (ii) короткие, прямые и вытянутые передние конечности (33%) и (iii) выраженный сколиоз с асимметричным развитием мышц спины (20%). На рисунке 1 показана соответствующая симптоматика. Мы выполнили полное вскрытие нескольких отобранных случаев, но не обнаружили дополнительных явных отклонений.Кроме того, рентгенологическое исследование искривленных хвостов и сколиотических шипов не выявило структурных дефектов позвонков (данные не представлены).

Хотя дефект сам по себе не является смертельным, в наиболее тяжелых случаях (~ 25%) были усыплены по соображениям социального обеспечения. Выжившие ∼75%, тем не менее, нанесли своим владельцам серьезные экономические потери в результате замедления роста и обесценивания туши.

CTS вызывается полностью пенетрантной делецией двух пар оснований в открытой рамке считывания (ORF) гена

MRC2

Ранее мы картировали локус CTS на хромосому 19 крупного рогатого скота в 2.Интервал 4 Мб гомозиготный по происхождению у восьми проанализированных случаев CTS [2]. Чтобы уточнить расположение на карте локуса CTS, мы генотипировали 105 зарегистрированных случаев CTS для пяти SNP, покрывающих интервал 2,4 Мб (рис. 2A). SNP были выбраны на основе низкой популяционной частоты аллеля, ассоциированного с заболеванием. Генотипирование было достигнуто путем первого секвенирования 35 пулов трех животных с последующим индивидуальным секвенированием пулов, выявляющим присутствие основного аллеля и, следовательно, одного или нескольких рекомбинантов.Такой подход позволил ограничить критическую область интервалом 812 Кбайт rs218 — AAFC03034831. Он включает семь аннотированных генов, которые были ранжированы на основе их предполагаемой значимости в отношении состояния CTS. Кодирующие экзоны были секвенированы у пораженного и подходящего здорового контрольного индивидуума.

Рисунок 2. Позиционная идентификация мутации c.2904_2905delAG MRC2 , вызывающей CTS, и ее влияние на белок Endo180.

(A) Генный состав 2.Интервал 4 Мб, в котором мутация CTS была локализована с использованием сопоставления идентичности по происхождению. Треугольники соответствуют пяти SNP, используемым для уточнения положения локуса CTS, с соответствующим количеством рекомбинантных особей из 105 случаев CTS. Результирующий нерекомбинантный (NR) интервал отмечен красной горизонтальной линией. (B) Структура гена MRC2 в этом интервале. (C) Доменный состав белка Endo180 дикого типа (WT) и мутанта (MUT). (D) Прослеженные последовательности, полученные из геномной ДНК гомозиготного животного дикого типа, носителя и гомозиготного CTS-животного, демонстрируют делецию динуклеотида ApG в мутанте.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000666.g002

В ходе этого процесса мы идентифицировали делецию 2 п.н. в ORF гена рецептора маннозы C типа 2 ( MRC2 ). Ген MRC2 кодирует эндоцитарный трансмембранный гликопротеин 180 кДа (Endo180), один из четырех членов семейства рецепторов маннозы [3], [4]. Endo180 представляет собой рециркулирующий эндоцитарный рецептор, который преимущественно экспрессируется в мезенхимальных клетках, таких как стромальные фибробласты, а также в хондроцитах и ​​остеобластах / остеоцитах в развивающихся костях, и предполагается, что он играет роль в регулировании деградации и ремоделирования внеклеточного матрикса.Он обладает лектиновой активностью С-типа, связывает коллаген и взаимодействует с рецептором активатора плазминогена урокиназного типа (uPAR) в тримолекулярном комплексе на поверхности клетки с проурокиназным активатором плазминогена (про-uPA). Белок Endo180 180 кДа включает аминоконцевой богатый цистеином домен неизвестной функции, домен фибронектина типа II, который опосредует связывание коллагена, восемь лектин-подобных доменов С-типа (CTLD), из которых второй опосредует Ca ²⁺ -зависимый лектин. активности, сигнал остановки-переноса, закрепляющий этот однопроходный трансмембранный белок в мембране, и карбоксиконцевой цитоплазматический домен, позволяющий связываться с адапторными белками в клатриновой оболочке.Мутация, выявленная в случаях CTS, расположена в экзоне 20 и удаляет нуклеотиды 2904 и 2905 кДНК MRC2 ( c.2904_2905delAG ). Предполагается, что к усеченному рецептору Endo180 будет присоединен 30-остаточный пептид со сдвигом рамки считывания, в котором отсутствуют домены CTLD6-8, сигнал остановки передачи и цитоплазматический домен (рис. 2B, C, D). В результате мутировавший белок не может локализоваться на плазматической мембране и опосредовать рецептор-опосредованный эндоцитоз.

Мы разработали 5′-экзонуклеазный тест на мутацию и генотипировали 105 зарегистрированных случаев CTS.Все оказались гомозиготными по мутации c.2904_2905delAG . Затем мы генотипировали 1899 здоровых бельгийских голубых животных. Неожиданно оказалось, что 24,7% животных являются носителями без единственного гомозиготного мутанта (p <10 ^-12 в предположении равновесия Харди-Вайнберга). Взятые вместе, эти результаты позволили нам признать мутацию c.2904_2905delAG причинной и полностью пенетрантной.

Мутант

MRC2 мРНК нацелены на путь наблюдения нонсенс-опосредованного распада (NMD) РНК

С.2904_2905delAG вызывает сдвиг рамки, приводящий к преждевременному стоп-кодону в 21 ^st гена 30-экзона MRC2 . Следовательно, предполагается, что мутантные мРНК подвергаются NMD [5]. Чтобы проверить это, мы сначала сравнили уровни мРНК MRC2 дикого типа и мутантной мРНК в легких и скелетных мышцах животного-носителя путем прямого секвенирования продуктов ОТ-ПЦР, содержащих делецию. Как видно из рисунка 3А, мутантная мРНК практически не обнаруживалась. Затем мы сравнили уровни мРНК MRC2 в легочной ткани животных трех генотипов, используя количественную ОТ-ПЦР, выполненную с наборами праймеров, нацеленных на 5′- и 3′-конец мРНК соответственно.Сильно значимое снижение уровней мРНК MRC2 наблюдалось у носителей по сравнению с гомозиготными особями дикого типа (75% ± 4% и 45% ± 6% от контрольных значений для 5 ‘и 3’ систем соответственно), тогда как MRC2 Уровни мРНК в случаях были менее 5% гомозиготных диких типов (рис. 3В). Таким образом, эксперименты по аллельному дисбалансу и qRT-PCR подтвердили деградацию мутантных транскриптов под действием NMD.

Рисунок 3. Нонсенс-опосредованный распад РНК c.2904_2905delAG мутантных транскриптов MRC2 .

(A) Прямое секвенирование ампликонов MRC2 , охватывающих мутацию CTS, полученную из геномной ДНК и легочной кДНК гетерозиготного животного, демонстрируя практически исключительное обнаружение аллеля дикого типа среди транскриптов (положение удаленных нуклеотидов подчеркнуто на красный, направление последовательности представлено треугольником). (B) Сравнение уровней мРНК MRC2 в легких животных + / +, + / CTS и CTS / CTS. Данные показаны для двух ампликонов на 5′- и 3′-концах мРНК соответственно.Планки погрешностей соответствуют стандартным ошибкам для трех повторов на образец.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000666.g003

Количество полноразмерного белка Endo180 уменьшено вдвое в тканях животных-носителей

Из десяти антител против Endo180 человека, протестированных с помощью вестерн-блоттинга, только одно поликлональное кроличье антитело (CAT2) обнаружило бычий белок Endo180 с достаточной специфичностью. Антитело CAT2 направлено против последних 19 аминокислот Endo180, из которых последние 18 полностью консервативны для человека и коровы [6].Таким образом, было предсказано, что CAT2 сделает возможным распознавание дикого типа, но не мутантного Endo180. Как и ожидалось, Endo180 дикого типа не был обнаружен в ткани легких животных, пораженных CTS. У животных-носителей уровни белка Endo180 были примерно вдвое меньше, чем у гомозиготных диких типов (рис. 4). Если предположить, что Endo180 чувствителен к дозировке, такое сокращение предположительно функциональных видов может повлиять на фенотип.

Рисунок 4. Влияние мутации CTS на уровни полноразмерного Endo180.

Результаты вестерн-блоттинга легких животных трех генотипов. Ху: контрольный образец человека. MW: маркер молекулярной массы. Полоса 55 кДа соответствует неспецифическому связыванию антитела CAT2 с тубулином, используемого в качестве контроля для количества загруженного белка.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000666.g004

Статус носителя CTS увеличивает мышечную массу

Необычно высокая частота мутации CTS в BBCB предполагает, что она может дать преимущество гетерозигот в этой тщательно отобранной популяции.Чтобы проверить эту гипотезу, мы оценили влияние генотипа носителя на 22 типовых признака, оценивающих мускулистость, скелетное строение, размер и прочность ног, которые систематически регистрируются в рамках программ отбора, реализуемых BBCB. Анализ проводился на 519 племенных быках, включая 148 животных-носителей и 371 гомозиготных животных дикого типа, с использованием смешанной модели, включающей фиксированные эффекты генотипа MRC2 , год проведения оценки, состояние тела и возраст при оценке, а также случайную особь. эффект животных.Компоненты дисперсии и эффекты оценивались методом ограниченного максимального правдоподобия (REML). Высоко значимые эффекты были получены для четырех категорий зарегистрированных признаков (таблица 1). Животные-носители CTS были меньше, коренастнее и мускулистее. У них был более тонкий скелет и более округлые ребра, характерные для мясного скота. MRC2 Генотип составлял 3,6%, 3,6% и 2,6% для генетической изменчивости роста, мускулатуры и общего внешнего вида, соответственно.Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что несущая частота CTS увеличивается с помощью программ выбора, применяемых в BBCB.

Мутация

C.2904_2905delAG подвергается выборочному сканированию

Чтобы более прямо продемонстрировать возникновение выборочной развертки, мы выполнили следующий анализ. Изучение доступных генеалогий 105 пострадавших людей показало, что все они восходят к Précieux, популярному производителю AI, через отца и мать. Это говорит о том, что Пресьё, 1980 года рождения, был носителем CTS и что его широкое использование в середине восьмидесятых привело к распространению мутации CTS в BBCB.Генотипирование Пресьё и трех его сыновей на мутацию C.2904_2905delAG и чип 60K Illumina действительно продемонстрировало, что он нес мутацию CTS, встроенную в общий гомозиготный по происхождению SNP гаплотип в исследованных случаях [2]. Таким образом, подавляющее большинство мутаций C.2904_2905delAG , встречающихся у современных животных BBCB, восходит к Пресьё.

Мы получили образцы ДНК от всех производителей BBCB (174), родившихся в период с 2003 по 2005 гг., Чья сперма была коммерциализирована одним из десяти основных бельгийских производителей ИО.Такие производители искусственного интеллекта тщательно отбираются из-за крайней мускулистости. Изучение родословных показало, что 160 из 174 [2003–2005] производителей AI были потомками Précieux. Число поколений, отделяющих этих производителей от Précieux, в среднем составляло 5,9 (диапазон: от 3 до 8). Генотипирование мутации C.2904_2905delAG в этой когорте выявило 45 носителей CTS, все они были среди 160 потомков Précieux.

Если предположить, что мутация CTS действительно подверглась селективному сканированию, 45 носителей из 160 потомков Précieux будут значительно выше, чем ожидалось случайно.Чтобы проверить это предположение, мы смоделировали сегрегацию мутации в истинной генеалогии 160 потомков Пресьё и подсчитали полученное количество быков-носителей. В этих моделированиях Précieux систематически считался носителем, в то время как частота мутации у животных, не связанных с Précieux, варьировалась от 0 до 0,05. В отсутствие отбора (то есть, если животное-носитель с одинаковой вероятностью передаст мутацию или аллель дикого типа любому из своих потомков), вероятность получить 45/160 носителей была равна 0.0014, 0,0023 и 0,0130 для частот мутаций (вне линии Précieux) 0,00, 0,01 и 0,05 соответственно (Таблица S1). Таким образом, мы можем с уверенностью утверждать, что мутация C.2904_2905delAG действительно подверглась избирательному сканированию в BBCB.

Чтобы получить некоторую количественную оценку интенсивности избирательного сканирования, мы повторили моделирование «отбрасывания гена», варьируя степень искажения сегрегации в пользу мутантного аллеля. На рис. 5 показана пропорция моделирования, дающего 45/160 быков-носителей, в зависимости от вероятности передачи мутации CTS от родителей-носителей к потомству.Можно видеть, что результат 45/160 быков-носителей наиболее вероятен для скорости передачи от 0,62∶0,38 (частота мутаций вне линии Précieux 0,05) и 0,67∶0,33 (частота мутаций вне линии Précieux ≤0,01). Тот факт, что все 105 случаев CST восходят к Précieux как со стороны матери, так и со стороны отца, указывает на то, что частота мутаций вне линии Precieux ближе к 1%, чем к 5%. Таким образом, вероятность выбора животного-носителя примерно в два раза выше, чем сибса-носителя.

Рис. 5. Распределение числа симуляций (из 10 000), дающих 45 носителей из 160 потомков Précieux (ось Y), в зависимости от скорости передачи мутации от гетерозиготных носителей (ось X).

Даны три кривые, соответствующие частотам мутации вне линии пресье, равным 0, 1 и 5%. Пунктирная красная вертикальная линия соответствует скорости передачи 67%, что максимизирует количество симуляций, дающих 45 носителей для частоты мутаций (за пределами линии Précieux) 1%, что считается верхней границей в BBCB.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000666.g005

Обсуждение

В данном документе мы описываем мутацию сдвига рамки считывания в гене MRC2 , вызывающую синдром CTS у крупного рогатого скота. В клинических проявлениях СТС преобладают скелетные и мышечные аномалии. Скелетные симптомы, включая задержку роста, неправильную форму ног и черепа, полностью совместимы с известным участием MRC2 в регуляции деградации и ремоделирования внеклеточного матрикса и его сильной экспрессии в развивающихся костях [7].Мышечные симптомы, включая мышечную гипертрофию, отклонение хвоста и спастический парез, труднее объяснить, хотя недавно сообщалось о роли родственного рецептора маннозы в подвижности миобластов и росте мышц [8]. Мы не можем формально исключить возможность того, что мышечные проявления являются результатом различных вариантов последовательности в неравновесном сцеплении с мутацией CTS, хотя мы поддерживаем более экономную гипотезу единственной причинной мутации.

Примечательно, что мышей, гомозиготных по целевой делеции MRC2 экзонов 2–6, были получены в двух независимых лабораториях [9], [10].Обе лаборатории сообщили, что мыши были жизнеспособными и плодовитыми, хотя недавно был продемонстрирован незначительный дефицит в росте длинных костей, минеральной плотности костной ткани и формировании костей свода черепа [7]. Клетки, полученные от этих животных, демонстрируют явный дефект поглощения и деградации коллагена. Одна из причин более выраженных клинических проявлений у крупного рогатого скота, чем у мышей, может заключаться в особой природе мутаций мышей и мутаций CTS MRC2 . Клетки, выделенные из генетически модифицированных мышей, экспрессируют вид мРНК, в котором экзон 1 (содержащий сигнальную последовательность) сплайсирован в рамке на экзон 7 (содержащий CTLD2), а в эмбриональных фибробластах усеченный белок Endo180, лишенный богатых цистеином, FNII и CTLD1 домены могут быть выражены [9].Однако в постнатальных тканях этих мышей с нокаутом обнаруживается мало или совсем отсутствует усеченный белок [10], [11]. В качестве альтернативы может быть, что существуют различные степени избыточности между членами семейства рецепторов маннозы у разных видов. Также более яркий фенотип у крупного рогатого скота может быть связан с различным генетическим фоном и, в частности, с тем фактом, что все исследованные животные были гомозиготными по мутации потери функции MSTN [1]. Эту гипотезу можно проверить путем скрещивания имеющихся мышей с нокаутом MRC2 и MSTN .Какой бы ни была причина, на данный момент CTS крупного рогатого скота может быть более информативной моделью для расшифровки функции MRC2 и для помощи в идентификации еще не идентифицированных патологических состояний человека, возникающих в результате потери функции MRC2 .

Мы предоставляем очень убедительные доказательства фенотипических проявлений мутации CTS у носителей. Это более чем вероятно отражает чувствительность к дозировке для Endo180, поскольку NMD вызывает присутствие мутантного белка на почти неопределяемых уровнях, таким образом, очень маловероятно, чтобы повлиять на клеточную функцию per se .Повышенная мускулистость носителей CTS предположительно внесла большой вклад в быстрое увеличение мутации CTS в BBCB. Действительно, мы демонстрируем, что у животных-носителей примерно в два раза больше шансов быть отобранными в качестве элитных производителей, чем у их братьев-носителей, не являющихся носителями. Обратите внимание, что это уровень искажения сегрегации, ожидаемый для гена, на который приходится ~ 5% генетической дисперсии для признака с наследуемостью ~ 25% и предполагающей интенсивность отбора ~ 2% (Таблица S2).

Такое избирательное обследование напоминает распространение других наследственных дефектов у домашних животных в результате выгодных черт, проявляемых носителями.К ним относятся мутации потери функции рианодинового рецептора свиньи и гена альфа-субъединицы натриевого канала скелетных мышц лошади, вызывающие, соответственно, злокачественную гипертермию и гиперкалиемический периодический паралич у гомозигот, но при этом увеличение мышечной массы у гетерозигот [12], [13] или мутации FGFR3 , вызывающей наследственную хондродисплазию у гомозиготных овец и увеличение размера у носителей [14], [15].

Диагностический тест на мутацию CTS был разработан и уже применен к более чем 4000 образцам BBCB.Полученная информация должна иметь немедленное и положительное влияние на заболеваемость CTS и защищать животных и заводчиков от патологического состояния и связанных с этим экономических потерь.

Эта работа является еще одной иллюстрацией значения популяций домашних животных в обогащении карты фенотип-генотип. Он дополняет недавний список успешных результатов позиционного клонирования домашней птицы [16], собак [17], [18], лошади [19] и крупного рогатого скота [2].

Материалы и методы

Сканирование мутаций

Кодирующие экзоны позиционных генов-кандидатов были амплифицированы из геномной ДНК случая CTS и подобранного контроля с использованием стандартных процедур.Праймеры, используемые для гена MRC2 , перечислены в таблице S3. Продукты ПЦР были напрямую секвенированы с использованием набора для секвенирования цикла терминатора Big Dye (Applied Biosystem, Foster City, CA). Электрофорез очищенных реакций секвенирования проводили на анализаторе ДНК ABI PRISM 3730 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Множественные следы последовательностей от пораженных животных и животных дикого типа сравнивали и сравнивали с использованием пакета Phred / Phrap / Consed (www.genome.washington.edu).

Диагностический анализ 5′-экзонуклеазы мутации CTS

Анализ Taqman был разработан для генотипирования мутации CTS с использованием 5′-GCG CAA CAG CAC CAG AGA-3 ‘и 5′-CTC CCT ACC TTG TTC AGG AAC TG-3′ в качестве праймеров для ПЦР и 5’-CTG CCG CCC AC [ * * ] GGG-3 ‘(CTS) и 5’-CTG CCG CCC AC [ AG ] G-3′ (дикий тип) в качестве зондов Taqman.Реакции проводили на приборе ABI7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) с использованием стандартных процедур.

Тест на аллельный дисбаланс NMD

Тотальную РНК экстрагировали из легких, сердца и скелетных мышц двухмесячного гетерозиготного животного c.2904_2905delAG с использованием Trizol (Invitrogen). РНК обрабатывали TurboDNase (Ambion). кДНК синтезировали с использованием системы синтеза первой цепи SuperscriptTMIII для ОТ-ПЦР (Invitrogen). Часть кДНК MRC2 , охватывающая делецию, амплифицировали с использованием специфических праймеров MRC2 (Таблица S4).Продукты ПЦР секвенировали напрямую, как описано выше.

Количественный ОТ-ПЦР-тест NMD

в реальном времени

Суммарная РНК из легких и скелетных мышц была получена от животных трех генотипов ( + / + , + / CTS и CTS / CTS ). После обработки ДНКазой (Turbo DNA-free, Ambion) 500 нг общей РНК подвергали обратной транскрипции в конечном объеме 20 мкл с использованием набора для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad). Реакции ПЦР проводили в конечном объеме 15 мкл, содержащем 2 мкл 2.5-кратно разведенная кДНК (соответствует 20 нг исходной общей РНК), 7,5 мкл 2-кратной мастер-смеси, приготовленной из основного набора qPCR для SYBR green I (Eurogentec), 0,45 мкл рабочего раствора 1/2000 SYBR green I, приготовленного из основной набор для qPCR для SYBR green I (Eurogentec), прямой и обратный праймеры (250 нМ каждый) и вода, свободная от нуклеаз. ПЦР проводили на приборе ABI7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) в следующих условиях цикла: 10 мин при 95 ° C, затем 40 циклов при 95 ° C в течение 15 секунд и 60 ° C в течение 1 мин.Два набора праймеров использовали для тестирования экспрессии MRC2 (MRC2_5’QRT_UP / DN и MRC2_3’QRT_UP / DN), и семь генов были включены в качестве кандидатов в эндогенные контроли: (1) Beta Actin (ACTB) , (2) Glyceraldehyde- 3-фосфатдегидрогеназа ( GAPD ), (3) гипоксантинфосфорибозилтрансфераза 1 (HPRT1) , (4) большой рибосомный белок P0 (RPLP0) , (5) рибосомный белок S18 6 ( Комплекс сукцинатдегидрогеназы, флавопротеин (SDHA) , субъединица А, и (7) белок активации Tyr-3- и Trp-5-монооксигеназы Beta (YWHAB) .После анализа результатов с помощью geNorm [20] четыре следующих гена были выбраны в качестве лучших эндогенных контролей: ACTB , RPLP0 , RPS18 и YWHAB . Соответствующие последовательности праймеров приведены в таблице S4. Все комбинации образец / ген анализировали в трех экземплярах. Относительные уровни экспрессии MRC2 для частей 5 ‘и 3’кДНК в образцах трех генотипов были рассчитаны с использованием программного пакета qBase (http: //medgen.ugent.be / qbase /) (Hellemans et al., 2007).

Вестерн-блоттинг

Ряд доступных антител, направленных против человеческого Endo180, тестировали вестерн-блоттингом на перекрестную реактивность с бычьим Endo180 на коммерческих эндотелиальных клетках бычьей аорты (BAOEC, Cell Applications). Положительный контроль, соответствующий лизату линии фибробластов человека MRC5, экспрессирующей Endo180, был включен в каждый эксперимент. Были протестированы следующие антитела: (i) семь моноклональных антител мыши (подробнее см. [21] — [23]), (ii) кроличьи поликлональные антитела (DEX), направленные против полноразмерного белка человека [21] и (iii) ) два кроличьих поликлональных антитела (CAT1 и CAT2) против пептида из C-концевого цитоплазматического домена человека (CATEKNILVSDMEMNEQQE), конъюгированного с KLH [6].После первоначального тестирования только антитело CAT2 было оставлено для дальнейших экспериментов. Быстро замороженные скелетные мышцы и ткани легких животных трех генотипов MRC2 (см. Выше) были разрушены и гомогенизированы с помощью системы лизирования тканей II (Quiagen). Получали экстракты сырого протеина и определяли общие концентрации протеина с помощью колориметрического теста (набор Pierce BCA Protein Assay, Thermo Scientific). Пятнадцать мкг разводили в 15 мкл конечного объема (1 × буфер для загрузки геля SDS) и наносили на 5% -ный пакет — 10% -ный раствор Трис-глицин SDS-полиакриламидный гель.Белки разделяли электрофорезом при 120-250 мА в течение 3 часов, визуализировали окрашиванием кумасси синим и электропереносили в течение ночи на PVDF-мембраны Hybond P (GE Healthcare). Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в PBS-Tween 20 (PBS-T) с последующей инкубацией с первичными антителами CAT2 (1–200) в общем объеме 3 мл в течение 1 ч 40 мин. После промывки специфический сигнал детектировали с использованием вторичных кроличьих антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой (Sigma), в соответствии с инструкциями производителя.

Статистический анализ

Фенотипы соответствовали 22 типовым признакам, связанным с мускулатурой, строением скелета, размером и крепостью ног, которые систематически регистрируются в BBCB [24]. Они были проанализированы с использованием смешанной модели, включающей генотип в локусе MRC2 (2), год проведения оценки (2), состояние тела (4) в качестве фиксированных эффектов, возраст на момент оценки в качестве ковариаты (квадратичная регрессия), аддитивный генетический эффект животных. и остаточный эффект как случайный эффект [25].Количество животных в матрице отношений составляло 6 356 человек. Компоненты дисперсии оценивались с использованием метода DFREML (ограничение максимального правдоподобия без производных) [26]. Часть генетической дисперсии из-за генотипа MRC2 оценивалась как разница между дисперсией из-за животной модели с генотипом MRC2 в модели и без него. Эффекты замещения аллелей (контраст) рассчитывали как разницу между средними значениями генотипа (+ / + и + / M), полученными из уравнений смешанной модели.

Свидетельство выборочной зачистки

Мы смоделировали сегрегацию гетерозиготной мутации от Précieux к его 160 [2003–2005] потомкам. Значения переменных параметров: (i) скорость передачи мутации от носителей к их потомству (от 0,5 до 0,75), (ii) частота мутации за пределами линии Précieux. Для каждого набора значений параметров было проведено 10 000 симуляций. Только не затронутые генотипы были взяты из вязок между гетерозиготными родителями.

Дополнительная информация

Таблица S2.

В таблице для различных значений δ показана доля фенотипической (P-PV) и генетической дисперсии (P-GV), объясняемой QTN в общей популяции. Предположим, что это нормально нарушенный признак с наследуемостью 25%, на который влияет QTN с MAF 1, равным 0,25, и с двумя возможными генотипами в популяции (+ / + и + / M), как в случае мутации CTS. Предположим, что средний фенотип популяции + / + равен -δ / 2, а популяции + / M равен + δ / 2.Предположим также, что остаточная дисперсия равна 1. В таблице для различных значений δ показана доля фенотипической (P-PV) и генетической дисперсии (P-GV), объясняемой QTN в общей популяции. Предположим, что выбираются будущие производители AI среди потомков популярных + / M гетерозиготных производителей. В таблице для пяти гипотетических пороговых значений фенотипа для отбора T = 1,00–2,00 показана доля выбранных сыновей (Prop-Sel), а среди выбранных сыновей соотношение носителей (+ / M) и лиц, не являющихся носителями (+ / +) (C / NC).Предполагалось, что плотины имеют + / + для простоты. Можно видеть, что наблюдаемый коэффициент сегрегации ∼2∶1, наблюдаемый для CTS, подразумевает интенсивность отбора порядка 0,02 для QTN, что составляет ∼0,05 генетической дисперсии в общей популяции. Соответствующие ячейки выделены серым.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000666.s002

(0,11 МБ PDF)

Благодарности

Мы благодарны Дмитрию Пироттину и Мэллори Дрей за их помощь в проведении количественной ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга соответственно; Дэвиду Робертсону за его помощь в определении характеристик антител Endo180; а также в Валлонскую селекционную ассоциацию (AWE) и Бельгийскую книгу поголовья голубой говядины (HBBBB) для получения информации о родословной и фенотипических данных по 22 типовым признакам.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: MG CC. Проведены эксперименты: CF AS WL NT IJH CC. Проанализированы данные: CF AS WL CM TD IJH CMI MG CC. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: AS MD IJH CMI WC. Написал статью: MG CC. Скрининг мутаций, NMD: CF. Сбор случаев, вскрытие, фенотипическое описание, анализ родословных: AS. Скрининг мутаций: WL. Коллекция кейсов: MD. Диагностический тест: NT. Модель животного: CM. Выборочная развертка: TD. Вестерн-блоттинг и иммуногистохимия: IJH, CMI.Пользовательская панель освещения iSelect: WC. Планировал эксперименты, анализировал данные, писал рукопись и курировал проект: CC, MG.

Список литературы

1. 1.
   Гробет Л., Мартин Л. Дж., Понселе Д., Пироттин Д., Брауэрс Б. и др. (1997) Делеция в гене миостатина крупного рогатого скота вызывает у крупного рогатого скота фенотип с двумя мускулами. Нат Генет 17: 71–74.
2. 2.
   Шарлье С., Коппитерс В., Роллин Ф., Десмехт Д., Агерхольм Дж. С. и др. (2008) Высокоэффективное картирование ассоциаций на основе SNP и управление рецессивными дефектами домашнего скота.Нат Генет 40: 449–454.
3. 3.
   East L, Isacke CM (2002) Семейство рецепторов маннозы. Biochim Biophys Acta 1572: 364–386.
4. 4.
   Behrendt N (2004) Рецептор урокиназы (uPAR) и uPAR-ассоциированный белок (uPARAP / Endo180): мембранные белки, участвующие в обновлении матрикса во время ремоделирования ткани. Biol Chem 385: 103–136.
5. 5.
   Chang YF, Imam JS, Wilkinson MF (2007) Нонсенс-опосредованный путь наблюдения за распадом РНК. Анну Рев Биохим 76: 51–74.
6. 6.
   Стердж Дж., Тодд С.К., Когианни Дж., Маккарти А., Исак С.М. (2007) Регулирование миграции макрофагальных клеток рецептором маннозы. J Leukoc Biol 82: 585–593.
7. 7.
   Wagenaar-Miller RA, Engelholm LH, Gavard J, Yamada SS, Gutkind JS, et al. (2007) Дополнительные роли внутриклеточных и перицеллюлярных путей деградации коллагена in vivo. Mol Cell Biol 27: 6309–6322.
8. 8.
   Янсен К.М., Павлат Г.К. (2006) Рецептор маннозы регулирует подвижность миобластов и рост мышц.J Cell Biol 174: 403–413.
9. 9.
   Ист Л., Маккарти А., Винке Д., Стердж Дж., Эшворт А. и др. (2003) Нацеленная делеция гена эндоцитарного рецептора Endo180 приводит к нарушению поглощения коллагена. EMBO Rep 4: 710–716.
10. 10.
    Engelholm LH, List K, Netzel-Arnett S, Cukierman E, Mitola DJ, et al. (2003) uPARAP / Endo180 необходим для поглощения коллагена клетками и способствует адгезии коллагена фибробластов. J Cell Biol 160: 1009–1015.
11. 11.Курино А.С., Энгельхольм Л.Х., Ямада С.С., Холмбек К., Лунд Л.Р. и др. (2005) Внутриклеточная деградация коллагена, опосредованная uPARAP / Endo180, является основным путем обновления внеклеточного матрикса во время злокачественного новообразования. J Cell Biol 169: 977–985.
12. 12.
    Фуджи Дж., Оцу К., Зорзато Ф., де Леон С., Ханна В.К. и др. (1991) Идентификация мутации в рецепторе рианодина свиньи, связанной со злокачественной гипертермией. Наука 253: 448–451.
13. 13.
    Рудольф Дж. А., Спир С. Дж., Бирнс Дж., Рохас К. В., Берноко Д. и др.(1992) Периодический паралич четвероногих лошадей: мутация натриевого канала, распространенная путем селективного разведения. Нат Генет 2: 144–147.
14. 14.
    Бивер Дж. Э., Смит М. А., Мейерс С. Н., Хадфилд Т. С., Боттема С. и др. (2006) Одноосновное изменение в домене тирозинкиназы II овечьего FGFR3 вызывает наследственную хондродисплазию у овец. Аним Генет 37: 66–71.
15. 15.
    Smith LB, Dally MR, Sainz RD, Rodrigue KL, Oberbauer AM (2006) Усиленный рост скелета овец, гетерозиготных по рецептору 3 инактивированного фактора роста фибробластов.J Anim Sci 84: 2942–2949.
16. 16.
    Райт Д., Бойже Х., Медоуз Дж. Р., Бедхом Б., Гуричон Д. и др. (2009) Вариация числа копий в интроне 1 SOX5 вызывает фенотип гороха-гребешка у кур. PLoS Genet 5: e1000512.
17. 17.
    Саттер Н.Б., Бустаманте С.Д., Чейз К., Грей М.М., Чжао К. и др. (2007) Один аллель IGF1 является основным определяющим фактором небольшого размера у собак. Наука 316: 112–115.
18. 18.
    Карлссон Е.К., Барановска И., Уэйд С.М., Салмон Хиллбертц Н.Х., Зоди М.К. и др.(2007) Эффективное картирование менделевских черт у собак через общегеномную ассоциацию. Нат Генет 39: 1321–1328.
19. 19.
    Розенгрен Пилберг Г., Головко А., Сундстрём Э., Курик И., Леннартссон Дж. И др. (2008) Цис-действующая регуляторная мутация вызывает преждевременное поседение волос и предрасположенность к меланоме у лошади. Нат Генет 40: 1004–1009.
20. 20.
    Hellemans J, Mortier G, De Paepe A, Speleman F, Vandesompele J (2007) Система относительной количественной оценки qBase и программное обеспечение для управления и автоматического анализа количественных данных ПЦР в реальном времени.Геном Биол 8: R19.
21. 21.
    Isacke CM, van der Geer P, Hunter T, Trowbridge IS (1990) p180, новый рециклирующий трансмембранный гликопротеин с ограниченной экспрессией клеточного типа. Mol Cell Biol 10: 2606–2618.
22. 22.
    Sheikh H, Yarwood H, Ashworth A, Isacke CM (2000) Endo180, гликопротеин рециркуляции эндоцитов, связанный с рецептором маннозы макрофагов, экспрессируется на фибробластах, эндотелиальных клетках и макрофагах и функционирует как рецептор лектина. J Cell Sci 113: 1021–1032.
23. 23.
    Wienke D, MacFadyen JR, Isacke CM (2003) Идентификация и характеристика эндоцитарного трансмембранного гликопротеина Endo180 как нового рецептора коллагена. Mol Biol Cell 14: 3592–3604.
24. 24.
    Hanset R, Michaux C, Boonen F (1994) Линейная классификация бельгийской голубой породы крупного рогатого скота: фенотипические и генетические параметры. Оттава, Канада, Международный комитет регистрации животных (ICAR), семинар, Регистрация продуктивности говядины и генетическая оценка.С. 231–237.
25. 25.
    Линч М., Уолш Б. (1997) Генетика и анализ количественных признаков. Сандерленд, Массачусетс: Sinauer Associates, Inc.